水稻E3泛素連接酶編碼基因DSG1的功能分析.pdf

1、株高和粒形是水稻最重要的農(nóng)藝性狀，其調(diào)控機理的研究一直被認為是將來提高水稻產(chǎn)量的重要手段。我們在EMS突變體庫中篩選到了一個穩(wěn)定遺傳的突變體，該突變體同時影響株高和粒形的發(fā)育，其株高顯著降低、籽粒明顯變短，因此將其命名為水稻矮化短粒突變體dwarf and short grain1（dsg1）。遺傳分析確定dsg1突變性狀是受一對隱性核基因控制。DSG1被定位在第3染色體70Kb范圍內(nèi)，該區(qū)間已有一個與dsg1表型類似的突變體報道。通過

2、測序獲得一個編碼U-box結構域的候選基因，并參與水稻株高和粒型的調(diào)控。在本研究中，我們將通過表型鑒定、基因定位和候選基因驗證等方法確定目的基因，最后通過表達模式分析、亞細胞定位、超表達分析、細胞學分析以及激素實驗等分析DSG1控制水稻株高及粒形的相關機理，為進一步開展基因互作等研究奠定基礎。具體結果如下：
　　1、形態(tài)學及農(nóng)藝性狀分析：與野生型相比，在苗期，dsg1突變體的根長和幼苗高度顯著減小，dsg1突變體葉鞘長度降低；在生

3、殖生長階段，dsg1突變體株高顯著降低，且所有節(jié)間長度變短；dsg1突變體籽粒長度減小、結實率降低；dsg1突變體小穗長度減少，平均單位面積細胞數(shù)顯著增加，小穗的平均細胞長度降低；dsg1突變體的劍葉、倒二和倒三葉寬度增加，且倒三葉長度縮短，dsg1突變體葉片的下部嚴重卷曲。
　　2、遺傳分析及基因定位：利用不育系西農(nóng)1A與dsg1突變體雜交，所有F1植株顯示正常表型，F(xiàn)2植物呈3：1（正常：矮化）的分離比，表明dsg1突變體表型

4、由單個隱性核基因控制。通過基因定位，DSG1基因被定位在第3染色體上的標記SSR3-28和 RM14645之間的190kb DNA區(qū)域；測序分析鑒定突變基因為LOC_Os03g13010。
　　3、DSG1的候選基因驗證：通過構建LOC_Os03g13010野生型DNA片段載體，轉化 dsg1突變體。陽性轉基因植株的突變表型得到了完全的恢復。因此確定LOC_Os03g13010就是DSG1的目的基因。
　　4、DSG1的表達

5、模式分析：通過qRT-PCR和ProDSG1::GUS在不同組織中檢測到DSG1表達。DSG1在根、莖、葉片、葉鞘和小穗中表達較好。其中，DSG1在葉和小穗中的表達水平高于其它組織。
　　5、亞細胞定位：將DSG1的編碼序列融合至GFP的N末端，去掉終止密碼子，并在35S啟動子控制下的水稻原生質(zhì)體中瞬時表達。DSG1蛋白主要定位于細胞核和細胞質(zhì)中。
　　6、超表達研究：通過構建超表達載體，并轉化中花11。DSG1表達量在超表

6、達植物中顯著增加。與野生型相比，超表達植株在植物高度或籽粒長度方面均沒有顯著差異。
　　7、細胞學分析：通過體式鏡、石蠟切片，掃描電鏡等分析，確定dsg1突變體中的突變表型是由于在不同組織中細胞分裂或細胞伸長缺陷造成的。同時 DSG1還參與了葉片側向發(fā)育。
　　8、激素途徑分析：dsg1突變體表現(xiàn)出典型的油菜素內(nèi)酯（BR）缺失表型，矮化和緊湊的株形，寬和直立的葉子，并且分蘗減少。葉夾角傾斜實驗表明 DSG1參與BR反應，屬于

7、 BR不敏感突變體。同時 BR途徑相關基因，OsD1、OsGSK1、OsMADS55和BZR1在dsg1成熟葉片中比在野生型中表達量下調(diào)。此外，通過qRT-PCR分析DSG1在用各種外源激素（包括BR、GA、IAA、ETH、SA和ABA）處理植株中的表達量變化情況。結果表明，DSG1被BR、ETH、IAA和SA抑制。這些結果說明DSG1參與了多種激素途徑。
　　9、E3泛素連接酶活性測定：DSG1編碼U-box結構域，E3連接酶活