晚疫病菌誘導的兩個馬鈴薯泛素連接酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、泛素-蛋白酶體通路在植物防衛(wèi)反應(包括過敏性反應)中發(fā)揮重要作用,泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)則是參與這一過程的重要組分。本研究旨在通過克隆和分析與馬鈴薯晚疫病抗性相關的泛素連接酶家族中的成員,初步揭示這類基因在馬鈴薯晚疫病垂直抗性和水平抗性中的調(diào)控作用,或它們在馬鈴薯防御晚疫病菌侵染的信號傳導網(wǎng)絡中的作用,為進一步深入開展抗性機理研究奠定基礎。
　　 本實驗室從晚疫病誘導的馬鈴薯水平抗性材料構(gòu)建的cDN

2、A文庫中篩選出兩個與煙草Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein(ACRE,具有泛素連接酶E3活性)基因有很高同源性的EST片段(10-A12和08-E12)。本研究中,我們克隆了這兩個EST片段所代表的基因,StRFP和StPUB,并研究了其生物學功能。
　　 StRFP基因的全長cDNA為1354 bp,包含一個789 bp的開放閱讀框(ORF),編碼262個氨基酸,含有高度保守的RING-H2型

3、RING指結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和GLD結(jié)構(gòu)域,是一個新的馬鈴薯ATL(Arabidopsis tóxico para levadura)蛋白。StRFP基因位于馬鈴薯第3條染色體上,不含內(nèi)含子。馬鈴薯基因組中可能有1～2個StRFP基因拷貝或與之同源性高的基因。利用洋蔥表皮細胞進行的StRFP-GFP融合蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示,StRFP在細胞膜上或膜外表達。RT-PCR分析結(jié)果表明,StRFP基因表達無組織特異性,在根、莖、葉、花、莖尖

4、、匍匐莖和塊莖等各種組織器官中組成型表達,但不同部位的表達水平有差異。離體葉片的晚疫病原菌接種表明,StRFP在接種24 h后表達增強,水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(ABA)和機械傷害處理能誘導其表達,乙烯(ETH)不能誘導其表達。試管苗在外界環(huán)境脅迫下的表達模式表明,StRFP對所研究的各種環(huán)境因素如NaCl、20％PEG、脫水、40℃熱激和4℃低溫都有響應,但對鹽脅迫和滲透脅迫的反應更明顯。為了進一步研究其功能,我

5、們分別構(gòu)建了CaMV35S驅(qū)動下的StRFP基因正義表達載體和RNAi抑制表達載體,采用根癌農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化鄂馬鈴薯3號(EP3)的試管薯,分別獲得超量表達株系27個和干涉株系6個。Southern雜交表明每個轉(zhuǎn)基因植株有1～3個拷貝。晚疫病病原菌接種實驗表明,與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?超量表達的轉(zhuǎn)基因株系更抗病,而抑制表達的株系更感病,說明StRFP基因為馬鈴薯抗晚疫病反應中的正向調(diào)控因子。
　　 StPUB基因全長2483 bp,

6、包含一個2175 bp的ORF,編碼724個氨基酸,GenBank登記號為EF091878。序列分析表明,StPUB蛋白具有保守的UND/U-box/ARM結(jié)構(gòu)域,與煙草ACRE276的氨基酸序列有89％的同源性。從馬鈴薯水平抗性材料(386209.10)、垂直抗性材料(鄂馬鈴薯3號,EP3)和感病材料(轉(zhuǎn)心烏,ZXW)中獲得StPUB基因的基因組DNA信息,序列分析表明該基因不含內(nèi)含子,且在三種不同抗性材料中大小一致,同源性達到97.

7、7％。通過TAIL-PCR與生物信息學分析,推測StPUB基因包含三個啟動子序列,可能位于馬鈴薯第2條染色體上。Southern blot雜交結(jié)果表明,馬鈴薯基因組中可能有2～3個StPUB拷貝或與之同源性高的基因。離體葉片的誘導表達模式研究表明,晚疫病病原菌接種24 h后,StPUB表達明顯增強,而且在三種不同的馬鈴薯抗性材料中表達趨勢一致；SA、ABA和機械傷害能激活StPUB表達,而MeJA和ETH不能誘導其表達。試管苗在外界環(huán)境

8、脅迫下的RT-PCR結(jié)果顯示,熱激(40℃)、低溫(4℃)、20％PEG或NaCl能誘導StPUB表達。采用RNAi技術,構(gòu)建了抑制StPUB基因表達的載體,并利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法導入馬鈴薯垂直抗性品種EP3中,共獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株13株。PCR檢測和Southern雜交結(jié)果表明,外源基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中,其拷貝數(shù)1～3個不等。對轉(zhuǎn)基因植株中StPUB基因的表達進行RT-PCR分析表明,StPUB基因在轉(zhuǎn)基因植株中的

9、表達量比對照顯著降低,RNAi能有效的抑制StPUB基因的表達。從晚疫病病原菌離體接種結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默StPUB的轉(zhuǎn)基因株系,其病斑生長速率(LGR)比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭?表明沉默StPUB基因降低了馬鈴薯的抗病性。轉(zhuǎn)基因株系試管苗耐鹽性試驗結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,沉默StPUB的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比,地上部分和根系生長相對較弱,根部腐爛的株數(shù)明顯增多,表明抑制StPUB表達降低了馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性。上述結(jié)果表明,StPUB在激