馬鈴薯StCYP707As基因的克隆與功能分析.pdf

1、馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）是僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。馬鈴薯塊莖是其繁殖、儲藏和產(chǎn)品器官。研究馬鈴薯塊莖形成的調(diào)控機(jī)制，不僅具有理論價值，而且對馬鈴薯的產(chǎn)量提高具有一定的指導(dǎo)意義。馬鈴薯塊莖發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，并受內(nèi)源以及外界因素的共同調(diào)控。外部因素包括光照、溫度、氮水平等;內(nèi)部因素包括光敏色素、轉(zhuǎn)錄因子、植物激素等。CO（CONSTANS）是植物開花誘導(dǎo)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。最近，我

2、們的研究發(fā)現(xiàn)，在StCOL反義抑制轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中，StCYP707A基因，ABA的分解中關(guān)鍵酶——8'-羥化酶(8'-hydoxylase)基因，受到StCOL的調(diào)控。為了揭示StCYP707A基因在馬鈴薯塊莖形成中的作用，本文從馬鈴薯克隆了StCYP707A1，StCYP707A2和StCYP707A3基因，并通過構(gòu)建StCYP707A1過表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株，初步分析了StCYP707A1對塊莖形成的作用。主要研究結(jié)果如下:

3、
　　1)采用RT-PCR從栽培品種馬鈴薯“Désirée”中克隆了StCYP707A1，該基因由6個內(nèi)含子和7個外顯子構(gòu)成，StCYP707A1cDNA序列含有一個全長為1407bp的開放閱讀框，編碼一個由469個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為53417.2Da，理論等電點(diǎn)為8.90的蛋白。StCYP707A1含有細(xì)胞色素P450半胱氨酸亞鐵血紅素配體，符合P450單加氧酶家族特征。StCYP707A1與其他同源蛋白氨基酸序列比對結(jié)果

4、表明StCYP707A1和與AtCYP707A2在同一簇上。組織表達(dá)分析顯示，StCYP707A1在未處理的栽培種馬鈴薯根，莖和葉中均有表達(dá)，但是葉中的表達(dá)量最高。同時該基因受低溫、干旱、高鹽、真菌及SA誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2)使用pCAMBIA1304載體，構(gòu)建了StCYP707A1基因的過表達(dá)和反義抑制載體1304-StCYP707A1、1304-StCYP707A1-F，通過農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，經(jīng)PCR檢測獲得了過表達(dá)植株4

5、株，反義抑制轉(zhuǎn)基因植株9株，塊莖產(chǎn)量分析顯示，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量與對照相比有明顯增加，而反義抑制轉(zhuǎn)基因植株則比野生對照植株產(chǎn)量低。轉(zhuǎn)基因株植塊莖淀粉含量方面，過表達(dá)植株均高于野生對照組，反義抑制植株均低于對照植株，且差異顯著。而總蛋白含量方面則差異不顯著。
　　3)采用RT-PCR從栽培品種馬鈴薯“Désirée”中克隆了StCYP707A2，StCYP707A2基因ORF為1425bp，編碼一個由475個氨基酸殘基組成的蛋白，

6、蛋白分子量為54271.9Da，理論等電點(diǎn)為9.31;StCYP707A2含有細(xì)胞色素P450半胱氨酸亞鐵血紅素配體，符合P450單加氧酶家族特征。StCYP707A2與其他同源蛋白氨基酸序列比對結(jié)果表明，StCYP707A2與S1CYP707A1關(guān)系較近。組織表達(dá)分析顯示，StCYP707A2在葉中表達(dá)表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量較弱，在根中幾乎檢測不到，該基因受低溫、干旱、高鹽、真菌及SA誘導(dǎo)表達(dá)。
　　4)采用RT-PCR從栽培

7、品種馬鈴薯“Désirée”中克隆了StCYP707A3，StCYP707A3的開放閱讀框?yàn)?329bp，含有5個內(nèi)含子，6個外顯子，編碼一個由443個氨基酸殘基組成，蛋白分子量為50524.0Da，理論等電點(diǎn)為8.95的蛋白。StCYP707A3含有細(xì)胞色素P450半胱氨酸亞鐵血紅素配體，屬于P450單加氧酶家族。StCYP707A3與其他同源蛋白氨基酸序列比對結(jié)果表明StCYP707A3與AtCYP707A2在同一簇上。組織表達(dá)分析