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文檔簡介
1、馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)屬于茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)植物,原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈,是繼水稻、小麥、玉米之后全球第四大糧食作物。晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具毀滅性的病害,全球每年因晚疫病造成的損失高達六十多億美元,嚴重威脅世界糧食安全。防控馬鈴薯晚疫病最經(jīng)濟有效的方法是選育抗病品種。但是長期以來,馬鈴薯抗晚疫病育種進展緩慢,加之快速進化的晚疫病菌(Phytophthora infestans)
2、會快速克服已有的抗病品種,因此目前急需新的策略和技術(shù)輔助選育持久抗病品種。效應(yīng)子組學(xué)已經(jīng)逐步成為一種快速高效鑒定馬鈴薯種質(zhì)資源中是否含有晚疫病抗性基因(Resistance to P.infestans, Rpi)的策略,大大加速了挖掘新抗病資源的步伐,為馬鈴薯持久抗病育種提供理論依據(jù)。本研究基于效應(yīng)子組學(xué)策略,以期篩選出晚疫病菌無毒基因和含有晚疫病抗病基因的馬鈴薯種質(zhì)資源,另外對候選無毒基因Pi23008,Pi22724,Pi2279
3、8的功能進行了深入研究。主要研究結(jié)果如下:
1.候選無毒基因的篩選
本研究挑選了晚疫病菌侵染馬鈴薯時早期上調(diào)表達的68個RxLR類效應(yīng)予,采用農(nóng)桿菌侵染方法將它們在116份不同基因型的馬鈴薯中進行瞬時表達,篩選到10個能夠在馬鈴薯葉片上誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的效應(yīng)子,分別是AVR2家族成員Pi23008,AVR-blb2家族成員RD39,細胞死亡激發(fā)子RD2,以及其它未知功能效應(yīng)子Pex147-2,RD8,RD49,Pi102
4、32,Pi11484,Pi07555和Pi22724。同時篩選到一個能夠在本氏煙草葉片上激發(fā)細胞死亡的效應(yīng)予(Pi22798)。
2.Rpi-R2同源基因的挖掘及其與AVR2家族基因的識別
基于候選無毒基因Pi23008屬于AVR2基因家族,我們進一步研究了Rpi-R2同源基因與AVR2家族基因間的識別關(guān)系。從4個不同基因型的馬鈴薯材料中克隆了4個Rpi-R2同源基因Rpi-SD27,Rpi-R2-like,Rpi-
5、hjt1.1和Rpi-IVP196,氨基酸與Rpi-R2相似率分別為82%,94%,92%,73%。通過四個同源基因與7個AVR2家族效應(yīng)子共表達分析發(fā)現(xiàn),Pi23008可以同時被Rpi-hjt1.1和Rpi-R2-1ike識別,而Pi13940只能被Rpi-hjt1.1識別。其他5個效應(yīng)子均不能與四個同源基因識別。進一步分析顯示能夠被識別的AVR2家族成員氨基酸序列均存在核輸出信號結(jié)構(gòu)域,而不能被識別的成員均不含有該結(jié)構(gòu)域。
6、 3.AVR2家族成員Pi23008和Pi13940的結(jié)構(gòu)、功能及識別機制分析
為了進一步研究效應(yīng)子Pi23008的識別功能域和識別機制,從9個不同P.infestans生理小種中克隆了9個Pi23008同源基因。分析顯示95位和98位氨基酸序列存在多態(tài)性。通過氨基酸定點突變實驗證實第95位亮氨酸(L)和第98位纈氨酸(V)對Pi23008同源基因與Rpi-hjt1.1識別起重要作用。同時還證實Pi13940第109位氨基酸(
7、K)對其與Rpi-hjt1.1識別起重要作用。
前人報道AVR2和Rpi-R2識別需要StBSL1參與。本研究通過酵母雙雜交證實AVR2家族蛋白Pi13940和Pi13940 C-term均能與StBSL1互作,而Pi13940K109M和Pi23008不能與StBSL1互作。雙分子熒光互補實驗也驗證了只有Pi13940可以與StBSL1互作。在本氏煙中沉默NbBSL1影響Pi13940與Rpi-hjt1.1的識別,但不影響P
8、i23008與Rpi-hjt1.1的識別,表明Pi13940和Pi23008與Rpi-hjt1.1通過不同機制來識別。
4.效應(yīng)子Pi22798的功能分析
通過候選無毒基因篩選,發(fā)現(xiàn)Pi22798可以激發(fā)本氏煙草和普通煙草細胞死亡,且該效應(yīng)子在本煙中低濃度表達可以促進P.infestans生長?;虮磉_模式顯示,Pi22798在P.infestans侵染馬鈴薯葉片24 h后就已上調(diào)表達。來自11個不同P.infest
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