馬鈴薯晚疫病菌四個RxLR基因的功能鑒定.pdf

1、馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起，能夠導致馬鈴薯的大幅減產，甚至絕收，嚴重威脅著馬鈴薯生產，被視為國際第一大作物病害。其病原菌在與植物協同進化的過程中，會分泌豐富的RxLR類效應分子，發(fā)揮了不同的致病作用，成為侵染的“武器”；同時，植物免疫系統(tǒng)進行防衛(wèi)反應形成“盾”，目前鑒定的抗晚疫病基因，其識別的無毒基因也都屬于病原菌RxLR類分泌蛋白。由于馬鈴薯栽培品種是四倍

2、體作物，自交不親和，通過雜交的方法將野生種中鑒定的抗病基因導入到栽培品種從而獲得抗病效果的策略只能在有限的資源中利用。因此，從野生種質資源中鑒定抗晚疫病基因并利用基因工程技術培育轉基因抗病馬鈴薯品種成為重要的防治策略之一。
　　龍葵作為馬鈴薯晚疫病非寄主茄科植物，對馬鈴薯晚疫病菌具有很好的抗性，預測攜帶相應的抗病基因資源。本研究通過構建我國A1融合群晚疫病黑龍江分離菌株HLJ1的RxLR蛋白基因池，進而在非寄主龍葵上篩選候選無毒基

3、因并進行分析，幫助解釋非寄主抗性的遺傳基礎并后續(xù)幫助從龍葵中克隆抗病基因。目前，取得的研究成果包括以下幾點：
　　1.參考已測序菌株T30-4基因組序列，以HLJ1菌株的gDNA為模板，通過高保真PCR，成功克隆并構建251個RxLR效應因子的瞬時表達載體。利用生物信息學手段分析兩個菌株T30-4和HLJ1基因組中RxLR分子的多態(tài)性，除了8個基因在部分菌株中存在等位基因缺失外，其它RxLR效應分子存在對應的等位基因。等位基因之間

4、編碼氨基酸序列完全相同數量相對較多，部分基因存在不同數量的多態(tài)性。
　　2.為研究 RxLR效應因子的功能，利用PVX介導的瞬時表達系統(tǒng)將構建的RxLR效應子分別在本氏煙和龍葵上進行瞬時表達，篩選得到3個僅能在龍葵上觸發(fā)過敏性壞死（HR）的基因，作為候選抗性無毒基因（Pi15718、Pi15556、Pi21190）。通過熒光定量分析發(fā)現這三個基因在 HLJ1侵染過程中表達量都出現明顯變化。通過對這3個RxLR效應分子的功能結構域的

5、截短分析發(fā)現，確定其與龍葵識別產生HR的關鍵區(qū)域都在C-端。
　　3.進一步解析 Pi15718的功能，對其在10個晚疫菌株中的多態(tài)性進行分析發(fā)現存在兩種類型的氨基酸序列，其中Pi15718HLJ1類可以在除龍葵品種（SN005）外的其他測試的龍葵上均產生 HR，Pi1571888069類不能在龍葵上產生 HR。推測氨基酸改變影響其在龍葵上產生HR的功能。有意思的是，Pi1571888069和Pi15718HLJ1的C末端單獨可以

6、激發(fā)龍葵的HR，暗示Pi1571888069N-端具有抑制C-端激活龍葵HR的功能。酵母雙雜交驗證N-端并不與C-端發(fā)生蛋白的互作。N-端抑制功能的關鍵位置確定在Pi1571888069的第45-52位的氨基酸之間。同時，為研究該候選無毒基因的功能，穩(wěn)定的轉基因株系以及酵母雙雜交篩選互作蛋白的工作也在進行中。
　　4.針對候選無毒基因Pi15556，研究發(fā)現在15個晚疫菌株中高度保守，氨基酸序列完全一致。其在供測的龍葵樣本 SN0

7、04、SN005、SN008中也不激發(fā) HR，體現無毒基因的特征。為了研究其在菌株中的功能，構建Pi15556的抑制突變體菌株，在鑒定了突變率分別為61.9％和34.7%的突變體M-1和M-2。對突變體進行生物學分析發(fā)現Pi15556并不影響菌落形態(tài)，菌絲生長和孢子囊形態(tài)，但預測可能通過影響產孢能力影響致病性。
　　5.Pi21190也有類似結果，在不同的龍葵材料中分別可激發(fā)或者不激發(fā) HR反應，體現無毒基因的特征。同時，其在不同

8、菌株中存在不同的等位基因，但其等位基因在龍葵SN0022上均產生HR，體現較強的保守性。
　　6.同期篩選到一個可以在本氏煙上抑制 INF1產生 HR的RxLR效應分子 Pi14684進行等位基因的多態(tài)性分析，發(fā)現其存在多個氨基酸位點的改變，在本氏煙上瞬時表達結果證明E43K，是其抑制INF1產生HR的關鍵位點。隨后為了研究Pi14684是否特異性的抑制INF1產生HR，分別接種SFI2，Avr3aKI和R3a混合菌液，發(fā)現Pi1