無選擇標記抗晚疫病轉基因馬鈴薯的獲得.pdf

1、馬鈴薯是全球第三大重要農(nóng)作物，僅次于小麥和玉米。由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的晚疫病，是導致馬鈴薯減產(chǎn)最嚴重的病害之一，在世界上絕大多數(shù)馬鈴薯的栽培地區(qū)廣泛傳播。采用傳統(tǒng)育種、化學農(nóng)藥等方法來防治馬鈴薯晚疫病雖然早有研究，但至今收效甚微。轉基因技術的興起為晚疫病的防治提供了新的鍥機。本實驗采用生物安全的轉基因方法，將抗晚疫病基因R1、RB、R3a轉化馬鈴薯栽培品種 Desiree，獲得生物安全的抗晚疫

2、病轉基因馬鈴薯。研究內(nèi)容如下：
　　1)無標記載體 pMF-LIC構建。以引物 OXN037/OXN038對質粒 pJG100進行PCR擴增，獲得LIC序列的片段，膠回收后與質粒pMF-GUS分別進行XbaⅠ/SacⅠ雙酶切，回收片段用 T4 DNA連接酶連接，熱激法轉化大腸桿菌 DB3.1，經(jīng)菌落PCR、質粒PCR和質粒XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及SacⅠ單酶切鑒定，成功構建了無標記植物表達載體pMF-LIC。
　　2)抗晚

3、疫病基因克隆到無標記載體上。分別用引物 OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096從質粒 pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR擴增出抗晚疫病基因R3a、R1、RB，同時用Apa I酶切載體pMF-LIC。用不依賴于連接反應的克隆（LIC）方法將抗晚疫病基因 R3a、R1、RB分別克隆到無標記植物表達載體pMF-LIC上，熱激法轉化大腸桿菌TOP10，

4、經(jīng)菌落PCR、質粒 PCR、質粒 XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及 SacⅠ單酶切驗證重組載體 pMF-R1/RB/R3a構建成功。
　　3)抗晚疫病基因工程農(nóng)桿菌獲得。通過三親融合，在幫助菌 HB101的幫助下將重組載體pMF-R1/RB/R3a轉入農(nóng)桿菌AGL0中，經(jīng)過菌落PCR、質粒PCR、質粒XbaⅠ/SacⅠ雙酶切及 SacⅠ單酶切鑒定，成功構建工程農(nóng)桿菌 AGL0-pMF-R1/RB/R3a。
　　4)無選擇標記抗晚疫