APC-CTE泛素連接酶介導(dǎo)MOC1的泛素化和降解的研究及水稻黃葉基因VYL的功能分析.pdf

1、本文涉及兩項(xiàng)研究課題內(nèi)容，即MOC1的泛素化及降解的研究和水稻黃葉基因VYL的功能分析。
　　分枝發(fā)育是影響植物形態(tài)建成的重要因素之一，其發(fā)育過(guò)程受多個(gè)遺傳途徑的調(diào)控。本研究上篇以水稻稀穗少分蘗突變體moc1-5（MONOCULM1-5）和多分蘗突變體te（TillerEnhancer）為研究材料，通過(guò)對(duì)其相互作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)APC/CTE復(fù)合體能夠介導(dǎo)MOC1的泛素化，導(dǎo)致MOC1進(jìn)入26S蛋白酶體進(jìn)行降解，從而揭示水稻分枝

2、（蘗）調(diào)控的一個(gè)新機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.和野生型相比，moc1-5突變體的小穗的一次枝梗、二次枝梗及小花數(shù)顯著減少，分蘗數(shù)明顯減少。此外，moc1-5突變體育性極差。
　　2.遺傳分析顯示moc1-5是單基因隱性突變體;采用圖位克隆的方法將目標(biāo)基因定位在6號(hào)染色體上約12Kb區(qū)間內(nèi)，包含1個(gè)開放閱讀框，即LOC_Os06g40780（MOC1）基因。突變體基因MOC1-5從ATG起第38位的C核苷酸缺失引起基因移

3、碼突變并導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，致使其功能缺失。Westernblot實(shí)驗(yàn)證明moc1-5突變體中缺失MOC1蛋白。
　　3.序列分析發(fā)現(xiàn)MOC1蛋白N端有一個(gè)典型的D-box結(jié)構(gòu)域。經(jīng)酵母雙雜交、體外pull-down實(shí)驗(yàn)證明，TE和MOC1之間存在依賴于D-box之間的互作。MOC1蛋白在te突變體中明顯積累;體外實(shí)驗(yàn)表明，te突變體不能泛素化和降解MOC1蛋白;moc1-5/te雙突變體的表型表明，TE作用于MOC1的上游。<

4、br>　　葉綠體是植物進(jìn)行光合作用主要場(chǎng)所。葉綠體中包含約3000種蛋白質(zhì)，保證這些蛋白的內(nèi)平衡是葉綠體發(fā)育和維持正常功能所必須的。本研究下篇以水稻轉(zhuǎn)綠型黃葉突變體vyl(virescentyellowleaf)為材料，在已經(jīng)獲得候選基因的基礎(chǔ)上，我們對(duì)該基因的功能進(jìn)行了深入的研究，揭示了VYL蛋白在水稻葉綠體生物合成中的重要作用以及Clp蛋白復(fù)合體亞基間的互作關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.水稻葉色突變體vyl是發(fā)育階段依賴型

5、的黃化突變體。突變體整個(gè)生育期表現(xiàn)為，新生葉片為白化表型，之后自頂端向下逐漸轉(zhuǎn)綠。葉綠體含量測(cè)定、超微結(jié)構(gòu)觀察、光合作用參數(shù)測(cè)定和葉綠體生物合成相關(guān)基因qRT-PCR檢測(cè)均表明，突變體的葉綠體正常生物合成受到了影響。
　　2.突變的VYL蛋白保留了葉綠體定位信號(hào)和部分S14_ClpP_2結(jié)構(gòu)域，但缺失了保守的Ser-His-Asp三聯(lián)體的催化位點(diǎn)以及多肽結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)基因組互補(bǔ)、過(guò)表達(dá)、microRNAi干擾等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LOC_O

6、s03g29810為目標(biāo)VYL基因。
　　3.VYL-GFP融合蛋白以點(diǎn)狀形式定位于水稻原生質(zhì)體的葉綠體中;qRT-PCR和GUS活性檢測(cè)結(jié)果表明:VYL在根、莖、葉、葉鞘、穗中均能表達(dá);葉綠體發(fā)育的早期表達(dá)量最高;VYL基因的表達(dá)量與光介導(dǎo)的葉綠體發(fā)育進(jìn)程相關(guān)。
　　4.進(jìn)化樹分析表明，VYL是擬南芥Clp蛋白酶亞基ClpP6在水稻中的同源蛋白?；プ鞣治霰砻?VYL與Clp蛋白酶亞基OsClpP3和OsClpP4分別互作，

7、突變體中VYL蛋白與OsClpP3、OsClpP4互作強(qiáng)度減弱。此外，OsClpP3還能和OsClpPT互作，OsClpP4也能和OsClp5、OsClpT分別互作。OsClpT和OsClpP4能夠自身互作。OsClpP3-GFP、OsClpP4-GFP融合蛋白也呈點(diǎn)狀定位于水稻原生質(zhì)體的葉綠體中。qRT-PCR結(jié)果表明OsClpP3、OsClpP4、OsClp5、OsClpT具有和VYL同樣的表達(dá)方式，在突變體中表達(dá)量上調(diào)。這些結(jié)果表