亮氨酸重復(fù)蛋白LRRC33對(duì)TLR信號(hào)通路的調(diào)味控以及泛素連接酶復(fù)合體介導(dǎo)Smoothened泛素化的研究.pdf

1、第一部分亮氨酸重復(fù)蛋白LRRC33對(duì)TLR信號(hào)通路的調(diào)控
　　Toll樣受體是機(jī)體防御病原微生物（病毒、細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌或寄生蟲）的先天性免疫反應(yīng)中的重要識(shí)別者[1]。盡管先天性免疫系統(tǒng)可以抵抗感染性病原體的侵襲，但是TLR信號(hào)通路的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)等嚴(yán)重后果。因此，抑制過(guò)度免疫反應(yīng)與維持先天性免疫穩(wěn)態(tài)是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。
　　本部分以LRRC33作為研究對(duì)象，通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)手段，闡述了其在抑制TLR信號(hào)通路活性過(guò)程中的重

2、要作用。利用RT-PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)，對(duì)LRRC33的組織分布進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LRRC33廣泛表達(dá)在機(jī)體的免疫器官中。利用NF-κB報(bào)告系統(tǒng)、免疫共沉淀和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，分析了LRRC33是否調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性以及其與TLRs之間的相互作用情況，并進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)，檢測(cè)了LRRC33對(duì)NF-κB亞單位p65的核轉(zhuǎn)移情況的影響，探討了LRRC33在TLR信號(hào)通路中的作用及其分子機(jī)制。構(gòu)建了LRRC33的缺失片段

3、（分別為L(zhǎng)RRC33的胞外區(qū)、LRRC33的胞內(nèi)區(qū)），分析了LRRC33的功能。最后，利用從人外周血中分離出的樹突細(xì)胞，分析了沉默LRRC33對(duì)人樹突細(xì)胞功能的影響。
　　主要結(jié)果:
　　1.通過(guò)利用分析跨膜區(qū)和基序預(yù)測(cè)的軟件SMART和Pfarm，本研究鑒定出一種新的TLR同源物-LRRC33，LRRC33蛋白的細(xì)胞外區(qū)域包含17個(gè)潛在的亮氨酸重復(fù)基序，但是LRRC33蛋白的胞內(nèi)區(qū)缺失了Toll/IL-1受體（TIR）區(qū)域

4、;RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示LRRC33廣泛表達(dá)在機(jī)體的免疫器官中，尤其是在骨髓、胸腺、肝臟、肺、腸、腎臟和心臟中高表達(dá);同時(shí)，本研究也分析了不同細(xì)胞系中LRRC33的表達(dá)情況，RT-PCR結(jié)果顯示LRRC33高表達(dá)于U937細(xì)胞和從人外周血分離出的單核細(xì)胞中，但是在從單核細(xì)胞向成熟樹突細(xì)胞分化的過(guò)程中，LRRC33的表達(dá)量逐漸降低。這表明LRRC33在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　2.免疫共沉淀結(jié)果顯示，LRRC33可

5、以與TLR2/TLR3/TLR4/TLR9都發(fā)生相互作用。相反地，LRRC33不與MyD88發(fā)生相互作用。例如，在HEK293T細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)LRRC33可以抑制TLR2/TLR4介導(dǎo)的基底水平上的NF-κB的激活;當(dāng)加入PGN/LPS刺激后，LRRC33可以顯著性抑制NF-κB的活性，并且大大降低了IL-8的釋放。同時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRRC33可以阻礙p65的核轉(zhuǎn)移過(guò)程。
　　3.通過(guò)構(gòu)建LRRC33的缺失突變體，本研究鑒定出LRRC

6、33負(fù)責(zé)與TLRs發(fā)生相互作用的具體區(qū)域。結(jié)果顯示，LRRC33的胞外區(qū)而非胞內(nèi)區(qū)可以與TLR2發(fā)生相互作，并且抑制NF-κB的活性和IL-8的釋放。LRRC33也可以通過(guò)抑制AP-1的活性從而阻礙JNK的激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證LRRC33胞外區(qū)的哪段LRRs介導(dǎo)了與TLRs的相互作用，本研究構(gòu)建了D1（缺失1-9 LRRs），D2（缺失10-14 LRRs），D3（缺失15 LRRs）和D4（缺失16-17 LRRs）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D1-D4

7、都可以與TLR2相互結(jié)合，并且抑制NF-κB的活性和IL-8的分泌。
　　4.沉默樹突細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)的LRRC33會(huì)導(dǎo)致NF-κB的激活，并且可以顯著性提高LPS刺激下TNF-α的釋放，同時(shí)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示沉默LRRC33的表達(dá)可以誘導(dǎo)LPS介導(dǎo)的JNK和p38的激活。
　　主要結(jié)論:
　　LRRC33在維持機(jī)體先天性免疫平衡的過(guò)程中發(fā)揮廣泛而且重要的作用。LRRC33能夠與多個(gè)TLR相互作用，抑制TLR

8、介導(dǎo)的NF-κB的激活，同時(shí)也可以抑制AP-1的激活，并降低多個(gè)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這表明了LRRC33是一個(gè)重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)者?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)了一種可以負(fù)調(diào)控TLR信號(hào)通路的包含LRR序列的蛋白-LRRC33。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)闡釋TLR信號(hào)通路和炎癥反應(yīng)在人類發(fā)育和疾病中的功能產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的意義，同時(shí)也將為治療人類過(guò)度免疫反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。
　　第二部分泛素連接酶復(fù)合體介導(dǎo)Smoothened泛素化的研究
　　Hedgehog(H

9、h)蛋白作為一種形態(tài)發(fā)生素在形態(tài)形成和細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[26]。Hh信號(hào)通路也與組織修復(fù)和干細(xì)胞維持相關(guān)。Hh信號(hào)通路的異常會(huì)導(dǎo)致先天性缺陷和癌癥的發(fā)生[27，35]。從果蠅到哺乳動(dòng)物中，Hh信號(hào)通路的傳導(dǎo)方式是保守的。其中Patched(Ptc)是信號(hào)受體;而七跨膜蛋白Smoothened(Smo)是信號(hào)傳導(dǎo)器，它也是Hh信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵組分。在過(guò)去十幾年中，科學(xué)家已經(jīng)對(duì)Smo進(jìn)行了廣泛的研究，但是Smo的作用機(jī)理仍然存在很

10、多疑團(tuán)。研究表明Hh和磷酸化可以正調(diào)節(jié)Smo，而去泛素化和泛素化負(fù)向調(diào)節(jié)Smo[68]。最近的研究表明沉默E1泛素激活酶Uba1也可以上調(diào)Smo的蛋白水平。泛素化是蛋白質(zhì)修飾的一種方式，它可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解、內(nèi)吞、相互作用和運(yùn)輸[28，33]。本研究旨在探討Smo泛素化的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本研究通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)手段探討了E3泛素連接酶是否參與Smo的調(diào)節(jié)過(guò)程，E3泛素連接酶怎樣調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平從而抑制其細(xì)胞表面聚集。利用RNAi篩

11、選方法尋找Smo的E3泛素連接酶。利用RNAi干擾技術(shù)靶向了一系列待定基因;利用基因修飾篩選的方法觀察了果蠅的表型特征;直接檢測(cè)了S2細(xì)胞中Smo的泛素化水平。通過(guò)沉默內(nèi)源性或過(guò)表達(dá)E2泛素結(jié)合酶Eff/E3泛素連接酶CG9153進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)Smo泛素化水平的影響。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)CG9153是否通過(guò)與Smo相互作用從而調(diào)節(jié)Smo的活性。通過(guò)構(gòu)建CG9153的缺失片段（包括N1、N2、HECT），檢測(cè)其與Smo結(jié)合的特定位點(diǎn)。

12、通過(guò)用溶酶體途徑抑制劑NH4Cl和蛋白酶體途徑抑制劑MG132處理S2細(xì)胞，檢測(cè)CG9153調(diào)節(jié)Smo的特異性。通過(guò)體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Cullins是否參與調(diào)節(jié)了Smo的泛素化水平。最后，通過(guò)顯微注射技術(shù)，檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或者沉默Uba1/Eff/CG9153/Cul4對(duì)果蠅翅盤中Smo聚集程度/蛋白水平的影響。
　　主要結(jié)果:
　　1.HECT家族的CG9153和Eff分別是Smo的泛素連接酶和泛素結(jié)合酶。沉默CG9153或

13、者Eff可以下調(diào)Smo的泛素化水平，相反地，過(guò)表達(dá)CG9153可以上調(diào)Smo的泛素化水平，但是過(guò)表達(dá)Eff則不可以。這表明Eff需要CG9153才可以將泛素分子傳遞給底物。此外，CG9153可以與Smo相互結(jié)合，而且Hh阻礙他們之間的相互作用從而降低Smo的泛素化水平。同時(shí)，Hh可以上調(diào)CG9153的泛素化水平，揭示了阻隔泛素連接酶與其底物的相互作用促使泛素分子在連接酶上累積。
　　2.CG9153調(diào)節(jié)Smo是通過(guò)蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)

14、的。
　　3.沉默果蠅體內(nèi)Eff/Uba1的表達(dá)可以增加Smo和Ci在翅盤中的聚集。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)果蠅體內(nèi)的CG9153以劑量反應(yīng)的趨勢(shì)下調(diào)Smo在翅盤中的聚集程度。
　　主要結(jié)論:
　　CG9153通過(guò)與Smo相互作用調(diào)控其泛素化水平。Uba1、Eff、 CG9153和Cul4形成泛素化復(fù)合體共同調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平，四者缺一不可。總之，本研究鑒定出CG9153聯(lián)合Cul4共同調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平，為深入