泛素連接酶Smurf1對干擾素信號的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　 干擾素(Interferons，IFNs)是機(jī)體內(nèi)一種重要免疫炎癥介質(zhì)，具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用。IFNs通過JAK-STAT信號通路激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）進(jìn)而啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。大量的研究證明，異常的IFNs信號會導(dǎo)致各種免疫性疾病的發(fā)生，目前調(diào)控IFNs信號的分子機(jī)制仍然不清楚。<

2、br>　　 Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1（Smad ubiquitination regulation factor1，Smurf1）是一種HECT型泛素連接酶，可以介導(dǎo)多種蛋白的泛素化降解。作為Smad1相互結(jié)合蛋白，Smurf1在1999年首次被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)Smurf1可以通過介導(dǎo)Smad1/5、TGF-βR、RhoA、MEKK2、Rrickle1、JunB等多種信號分子的泛素化降解來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β（Transformin

3、g growth factor，TGF-β）信號通路。雖然Smurf1在TGF-β信號通路中的作用已經(jīng)被很好的闡釋，但是Smurf1在其他信號通路尤其是在免疫反應(yīng)中的作用還不清楚。最近有兩篇文獻(xiàn)報道了Smurf1在免疫系統(tǒng)中的作用:Smurf1可以介導(dǎo)在免疫反應(yīng)中起重要作用的TRAFs發(fā)生泛素化降解;Smurf1與Smurf2、Smad6形成一個復(fù)合物，通過介導(dǎo)髓樣分化因子88（Myeloid differentiation prima

4、ry response gene88，MyD88）的泛素化降解負(fù)向調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)信號通路。
　　 為了研究Smurf1在免疫反應(yīng)中的作用，我們探討了Smurf1對IFNs信號通路的影響，并闡述了其分子機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1.利用Smurf1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過雙熒光素酶報告基因(Dual-Luciferase repo

5、rter assay system，DLR)的方法檢測Smurf1對IFN-γ誘導(dǎo)GAS-luc報告基因活化的影響，以及Smurf1對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS;也被稱作Nos2）啟動子活性的影響。
　　 2.利用Smurf1特異性的siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測Smurf1對Ⅳos2、Irf1、Cxcl9、Cx

6、cl10、Ly6e、Ifi203等IFNs目標(biāo)基因表達(dá)的影響。
　　 3.利用免疫共沉淀(Co-IP)、免疫熒光(IF)等技術(shù)研究Smurf1和STAT1的相互作用;利用Smurf1的截斷突變體和STAT1的點(diǎn)突變體尋找介導(dǎo)Smurf1和STAT1發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域或基序。
　　 4.利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和體內(nèi)泛素化實驗探討Smurf1對STAT1蛋白水平及泛素化水平的影響;利用STAT1的磷酸化位點(diǎn)突變體探討Smurf1介

7、導(dǎo)STAT1泛素化與STAT1磷酸化的關(guān)系。
　　 5.利用病毒感染及病毒空斑實驗研究Smurf1在IFN-γ介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)中的作用。
　　 6.分別用IFN-γ和IFN-β刺激RAW264.7、小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞、NIH3T3、HEK293等不同細(xì)胞，通過Western blot的方法檢測IFNs對Smurf1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.Smurf1負(fù)向調(diào)控IFNs信號
　　 為

8、了研究Smurf1在免疫反應(yīng)中的作用，我們首先探討了Smurf1對IFNs信號的影響。為了研究Smurf1對IFNs信號的影響，我們先檢測了Smurf1過表達(dá)對IFN-γ誘導(dǎo)的GAS-luc報告基因的影響。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，我們發(fā)現(xiàn):高表達(dá)Smurf1能顯著的抑制IFN-γ誘導(dǎo)的GAS-luc報告基因的活性，而且這種抑制作用隨著Smurf1表達(dá)量的增加而更加顯著。同時，我們還檢測了Smurf1對IFN-γ目標(biāo)基因iNOS啟動子

9、活性的影響，Smurf1同樣可以顯著的抑制iNOS啟動子報告基因的活性。
　　 為了更加直接的研究Smurf1對IFN-γ誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響，我們利用Smurf1特異性的siRNA沉默小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中Smurf1的表達(dá)，然后通過qRT-PCR檢測IFN-γ目標(biāo)基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn):當(dāng)Smurf1被沉默之后，IFN-γ誘導(dǎo)的Nos2、Irf1、Cxcl9和Cxcl10的表達(dá)都顯著升高。與之類似，當(dāng)Smurf1被沉默之后，IF

10、N-β誘導(dǎo)的Cxcl9、Cxcl10、Ly6e和Ifi203的表達(dá)也都顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果提示我們:Smurf1可以負(fù)向調(diào)節(jié)IFNs信號通路。
　　 2.Smurf1可以與STAT1發(fā)生組成性結(jié)合
　　 Smurf1可以同時抑制IFN-β信號和IFN-γ信號，而IFN-β信號和IFN-γ信號下游一個重要的共同分子就是STAT1。而且，之前的相互作用組學(xué)研究預(yù)測了Smurf1和STAT1可以相互結(jié)合。因此，我們提出假設(shè):Sm

11、urf1通過靶向STAT1進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)IFNs信號。
　　 為了證實Smurf1與STAT1可以發(fā)生相互作用，我們將Smurf1和STAT1的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，然后分別用相應(yīng)的抗體做Co-IP和Western Blot。結(jié)果發(fā)現(xiàn):外源性的Smurf1和STAT1可以發(fā)生相互結(jié)合。然后，我們在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中證實:內(nèi)源性的Smurf1可以不依賴于IFNs的刺激與內(nèi)源性的STAT1發(fā)生組成性的結(jié)合

12、。
　　 之前大量的研究報道了Smurf1主要是通過其WW結(jié)構(gòu)域與底物蛋白富含脯氨酸的PY基序發(fā)生相互結(jié)合。為了尋找Smurf1中介導(dǎo)其與STAT1發(fā)生相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，我們將Smurf1的各種截斷突變體與全長STAT1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293中，Co-IP和Western Blot的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):Smurf1通過其WW結(jié)構(gòu)域與STAT1的發(fā)生相互結(jié)合。對STAT1的氨基酸序列進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)STAT1的663位至666位氨基

13、酸序列為PLKY，形成了潛在的PY基序。為了確定STAT1是否是通過其PY基序與Smurf1發(fā)生相互結(jié)合的，我們構(gòu)建了PY基序突變體，并將其與Smurf1過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293。Co-IP和Westem Blot的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):PY基序發(fā)生突變的STAT1失去了與Smurf1結(jié)合的能力。這些結(jié)果提示我們:Smurf1可以通過WW結(jié)構(gòu)域與STAT1的PY基序發(fā)生組成性的結(jié)合。
　　 3.Smurf1介導(dǎo)STAT1的泛素化降解

14、
　　 Smurf1是一種可以介導(dǎo)多種分子發(fā)生泛素化降解的泛素連接酶，而且Smurf1可以與STAT1發(fā)生相互結(jié)合的，這就促使我們?nèi)パ芯縎murf1對STAT1降解的影響。我們將STAT1過表達(dá)質(zhì)粒與不同量的Smurf1野生型過表達(dá)質(zhì)?；騍murf1泛素連接酶活性位點(diǎn)突變體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):野生型Smurf1過表達(dá)可以顯著降低STAT1的蛋白水平，而Smurf1泛素連接酶活性位點(diǎn)突

15、變體對STAT1的蛋白水平?jīng)]有影響。與之類似，Smurf1過表達(dá)可以顯著降低內(nèi)源性STAT1的蛋白水平。為了在生理條件下研究Smurf1對STAT1的影響，我們利用Smurf1特異性的siRNA將小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中Smurf1沉默，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染Smurf1特異性siRNA組的STAT1蛋白水平明顯比轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組高。這些結(jié)果提示我們:Smurf1可以影響STAT1的蛋白水平，而且這種影響與其泛素連

16、接酶活性有關(guān)。
　　 Smurf1作為一種泛素連接酶可以降低STAT1的蛋白水平，因此，我們提出假設(shè):Smurf1可以介導(dǎo)STAT1發(fā)生泛素化降解。為了驗證我們的假設(shè)，我們首先利用體內(nèi)泛素化實驗檢測了Smurf1對STAT1泛素化的影響。我們發(fā)現(xiàn):在野生型Smurf1存在的情況下，STAT1的泛素化水平明顯升高，而Smurf1泛素連接酶活性位點(diǎn)突變體對STAT1的泛素化水平?jīng)]有影響。大量研究表明:不同的蛋白分子可以發(fā)生不同形式的

17、泛素化，而泛素化的形式?jīng)Q定了蛋白分子不同的命運(yùn)。接下來，我們利用泛素突變體和體內(nèi)泛素化實驗研究了Smurf1介導(dǎo)STAT1發(fā)生泛素化的形式。實驗結(jié)果表明:Smurf1可以顯著增加STAT1 K48位的聚泛素化，而對STAT1 K63位聚泛素化沒有影響。之前的研究表明:發(fā)生K48位聚泛素化的蛋白可以被26S蛋白酶體所識別并降解。與之一致，我們發(fā)現(xiàn)26S蛋白酶體抑制劑MG132可以消除Smurf1對STAT1蛋白水平的影響。這些實驗結(jié)果證明

18、:Smurf1可以介導(dǎo)STAT1發(fā)生K48位的聚泛素化，并被26s蛋白酶體識別降解。
　　 4.Smurf1介導(dǎo)STAT1的泛素化不依賴于STAT1的磷酸化
　　 STAT1的Tyr701和Ser727磷酸化對于STAT1發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活作用起著非常重要的作用。之前有研究報道，泛素連接酶SLIM介導(dǎo)STAT1泛素化降解依賴于STAT1的磷酸化。Smurf1介導(dǎo)STAT1的泛素化是否依賴于STAT1的磷酸化呢？為了回答這個問

19、題，我們構(gòu)建了STAT1磷酸化位點(diǎn)突變體，將其與不同量的Smurf1過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):過表達(dá)Smurf1可以降低野生型STAT1和STAT1磷酸化位點(diǎn)突變體的蛋白水平。與之一致，體內(nèi)泛素化實驗結(jié)果顯示:過表達(dá)Smurf1可以增加野生型STAT1和STAT1磷酸化位點(diǎn)突變體泛素化水平。這些實驗結(jié)果證明:Smurf1介導(dǎo)STAT1發(fā)生泛素化降解不依賴于STAT1的磷酸化。
　　

20、 5.Smurf1負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)
　　 IFNs對于機(jī)體抵抗病毒感染發(fā)揮著非常重要的作用，而Smurf1是IFNs信號的一種抑制因子。因此，我們推測Smurf1可能會在機(jī)體抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮一定的作用。為了探討Smurf1對IFN-γ介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的影響，我們用VSV病毒感染高表達(dá)Smurf1的HEK293細(xì)胞和沉默Smurf1的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞，然后利用病毒空斑實驗和實時定量PCR檢測病毒的復(fù)制情況。病毒空

21、斑實驗表明:轉(zhuǎn)染野生型Smurf1組細(xì)胞上清中病毒滴度明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，而轉(zhuǎn)染Smurf1泛素連接酶活性位點(diǎn)突變體組細(xì)胞上清中病毒滴度相對于空質(zhì)粒組沒有明顯變化。同樣的，轉(zhuǎn)染野生型Smurf1的HEK293細(xì)胞中VSV的RNA復(fù)制數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和泛素連接酶活性位點(diǎn)突變體組。為了進(jìn)一步驗證Smurf1在生理情況下的抗病毒作用，我們用Smurf1特異性的siRNA轉(zhuǎn)染小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞并用IFN-γ刺激，然后用VSV病毒感染。病

22、毒空斑實驗表明，沉默Smurf1的表達(dá)顯著降低了巨噬細(xì)胞上清中的病毒滴度。qRT-PCR的結(jié)果同樣表明，沉默Smurf1的表達(dá)顯著降低了巨噬細(xì)胞內(nèi)VSV的RNA復(fù)制數(shù)。這些結(jié)果提示我們:Smurf1可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。
　　 6.IFN-γ誘導(dǎo)Smurf1的表達(dá)
　　 前面實驗研究了Smurf1對IFNs信號的影響，接下來我們探討IFNs對Smurf1表達(dá)的影響。我們用IFN-β、IFN-γ刺激RAW264

23、.7、小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞、NIH3T3、HEK293等不同細(xì)胞，通過Westem blot的方法檢測IFNs對Smurf1表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明:IFN-γ可以在RAW264.7、小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞、NIH3T3、HEK293等多種細(xì)胞中誘導(dǎo)Smurf1的表達(dá)，而IFN-β對無法誘導(dǎo)Smurf1的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.泛素連接酶Smurf1可以通過介導(dǎo)STAT1的泛素化降解負(fù)向調(diào)控IFNs信號。
　　

24、 2.Smurf1可以通過其WW結(jié)構(gòu)域和STAT1的PY基序與STAT1組成性結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)STAT1發(fā)生K48位的聚泛素化，并被26S蛋白酶體識別降解。
　　 3.Smurf1可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)。
　　 4.IFN-γ可以誘導(dǎo)Smurf1的表達(dá)，Smurf1形成一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)控IFN-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)了HECT型泛素連接酶Smurf1可以負(fù)向

25、調(diào)節(jié)IFNs信號通路，豐富了我們對Smurf1在免疫反應(yīng)中的作用的理解。
　　 2.在本研究中，我們闡明了Smurf1抑制IFNs信號的一種可能的分子機(jī)制。我們明確了STAT1作為一個新的靶點(diǎn)，可以被Smurf1識別并發(fā)生泛素化。這個發(fā)現(xiàn)拓寬了Smurf1的底物譜，同時也證明了機(jī)體中除了SLIM存在另一種泛素連接酶可以介導(dǎo)STAT1發(fā)生泛素化。
　　 3.之前的研究發(fā)現(xiàn)由SLIM介導(dǎo)的STAT1泛素化依賴于STAT1磷酸

26、化，有趣的是我們發(fā)現(xiàn)STAT1的磷酸化對Smurf1介導(dǎo)STAT1泛素化并不是必須的，因此Smurf1可能是STAT1在整體水平上的一種調(diào)節(jié)因子。
　　 4.本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以誘導(dǎo)Smurf1的表達(dá)，Smurf1進(jìn)而通過介導(dǎo)STAT1的泛素化降解來負(fù)向調(diào)節(jié)IFN-γ信號，揭示了一種新的IFN-γ信號負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 局限性
　　 1.本研究雖然發(fā)現(xiàn)了Smurf1可以介導(dǎo)STAT1發(fā)生泛素化降解，但是沒