E3泛素連接酶RNF2在I型干擾素抗病毒天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控功能及其機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是機(jī)體抵抗病毒侵襲的第一道防線?？共《咎烊幻庖叻磻?yīng)的不足或過(guò)強(qiáng)，都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，因此對(duì)抗病毒天然免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制研究具有重要的意義。翻譯后修飾(Post-translational modification，PTM)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用，其中由E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化修飾是必不可少的一種，但是含有RING結(jié)構(gòu)域的E3家族(RING E3s)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的功能還沒(méi)有被完

2、全解析。
　?、裥透蓴_素(TypeⅠinterferon，IFN-Ⅰ)信號(hào)通路的激活是抗病毒天然免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，由轉(zhuǎn)錄因子STAT1(Signal transducer and activator of transcription1)介導(dǎo)產(chǎn)生的一系列干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)則最終決定了抗病毒反應(yīng)的效應(yīng)。然而，過(guò)度激活的IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)不僅不能夠維持抗病毒效應(yīng)，

3、還會(huì)引起免疫系統(tǒng)的抑制，導(dǎo)致慢性的病毒感染。因此，對(duì)IFN-FSTAT1信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控機(jī)制研究對(duì)于IFN-Ⅰ的臨床應(yīng)用具有重要的價(jià)值。
　　為尋找抗病毒天然免疫反應(yīng)新的調(diào)控分子，解析RING E3家族在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用及機(jī)制，對(duì)小鼠的115個(gè)RING E3基因進(jìn)行了以siRNAs(Small interfering RNAs)干擾為基礎(chǔ)的高內(nèi)涵篩選。通過(guò)與對(duì)照干擾的結(jié)果相比較，共鑒定到9個(gè)正向的調(diào)控分子及30個(gè)負(fù)向調(diào)

4、控分子。為進(jìn)一步尋找IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)的新的負(fù)向調(diào)控分子，對(duì)篩選到的30個(gè)負(fù)向調(diào)控分子進(jìn)行了第二輪篩選。通過(guò)外源加入IFN-β后，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)分子仍然表現(xiàn)出負(fù)向調(diào)控的作用，說(shuō)明這9個(gè)分子主要通過(guò)對(duì)IFN-Ⅰ/STAT1信號(hào)的負(fù)向調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗病毒天然免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。
　　在這9個(gè)分子中，選取了具有顯著效應(yīng)的ring finger protein2(RNF2)進(jìn)行了詳細(xì)的功能和機(jī)制研究。通過(guò)體外干擾，細(xì)胞和小鼠水平的基因敲

5、除，細(xì)胞水平的過(guò)表達(dá)等一系列試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RNF2無(wú)論是體外還是體內(nèi)，均能夠負(fù)向調(diào)控VSV或IFN-Ⅰ刺激的ISGs的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞和小鼠對(duì)病毒的抵抗能力。通過(guò)相互作用質(zhì)譜及泛素化修飾定量質(zhì)譜，鑒定了15個(gè)RNF2在抗病毒反應(yīng)中的潛在底物，其中包括轉(zhuǎn)錄因子STAT1，同時(shí)還鑒定到了STAT1上可能受RNF2調(diào)控的12個(gè)潛在賴(lài)氨酸位點(diǎn)。通過(guò)免疫沉淀和體外GST pull down的方法，證明了RNF2與STAT1的直接相互作用，并且通過(guò)轉(zhuǎn)

6、染一系列的RNF2或STAT1截短體，泛素分子突變體后進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RNF2主要通過(guò)其RING結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)IFN-Ⅰ刺激下STAT1的K33位連接的多聚泛素化修飾，并抑制了STAT1介導(dǎo)的啟動(dòng)子序列ISRE的轉(zhuǎn)錄活性。在機(jī)制的研究中，利用染色質(zhì)免疫沉淀，體外的DNA pull down等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNF2并不影響IFN-I/STAT1信號(hào)通路的激活，而是通過(guò)修飾STAT1的DNA結(jié)合區(qū)域的K379位點(diǎn)促進(jìn)STAT1與DNA的解離，間

7、接促進(jìn)其發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，從而及時(shí)抑制IFN-I/STAT1信號(hào)。
　　研究不僅系統(tǒng)性地解析了RING E3分子在抗病毒天然免疫領(lǐng)域內(nèi)的調(diào)控功能，還發(fā)現(xiàn)了一系列抗病毒天然免疫反應(yīng)的新的調(diào)控分子，更為IFN-I/STAT1信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控提供了新的機(jī)制。因此，研究結(jié)果具有臨床指導(dǎo)和轉(zhuǎn)化價(jià)值，不僅為治療病毒感染提供了新的潛在靶點(diǎn)和思路，為新的抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，也為增強(qiáng)IFN-Ⅰ的治療效果，防止IFN-Ⅰ過(guò)度活化或長(zhǎng)期應(yīng)