E3泛素連接酶RNF2在I型干擾素抗病毒天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控功能及其機制研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)是機體抵抗病毒侵襲的第一道防線?？共《咎烊幻庖叻磻?yīng)的不足或過強，都會導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，因此對抗病毒天然免疫反應(yīng)的調(diào)控機制研究具有重要的意義。翻譯后修飾(Post-translational modification，PTM)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用，其中由E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化修飾是必不可少的一種，但是含有RING結(jié)構(gòu)域的E3家族(RING E3s)在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的功能還沒有被完

2、全解析。
　?、裥透蓴_素(TypeⅠinterferon，IFN-Ⅰ)信號通路的激活是抗病毒天然免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，由轉(zhuǎn)錄因子STAT1(Signal transducer and activator of transcription1)介導(dǎo)產(chǎn)生的一系列干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)則最終決定了抗病毒反應(yīng)的效應(yīng)。然而，過度激活的IFN-Ⅰ/STAT1信號不僅不能夠維持抗病毒效應(yīng)，

3、還會引起免疫系統(tǒng)的抑制，導(dǎo)致慢性的病毒感染。因此，對IFN-FSTAT1信號通路的負(fù)向調(diào)控機制研究對于IFN-Ⅰ的臨床應(yīng)用具有重要的價值。
　　為尋找抗病毒天然免疫反應(yīng)新的調(diào)控分子，解析RING E3家族在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用及機制，對小鼠的115個RING E3基因進(jìn)行了以siRNAs(Small interfering RNAs)干擾為基礎(chǔ)的高內(nèi)涵篩選。通過與對照干擾的結(jié)果相比較，共鑒定到9個正向的調(diào)控分子及30個負(fù)向調(diào)

4、控分子。為進(jìn)一步尋找IFN-Ⅰ/STAT1信號的新的負(fù)向調(diào)控分子，對篩選到的30個負(fù)向調(diào)控分子進(jìn)行了第二輪篩選。通過外源加入IFN-β后，發(fā)現(xiàn)有9個分子仍然表現(xiàn)出負(fù)向調(diào)控的作用，說明這9個分子主要通過對IFN-Ⅰ/STAT1信號的負(fù)向調(diào)控來實現(xiàn)對抗病毒天然免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。
　　在這9個分子中，選取了具有顯著效應(yīng)的ring finger protein2(RNF2)進(jìn)行了詳細(xì)的功能和機制研究。通過體外干擾，細(xì)胞和小鼠水平的基因敲

5、除，細(xì)胞水平的過表達(dá)等一系列試驗，發(fā)現(xiàn)RNF2無論是體外還是體內(nèi)，均能夠負(fù)向調(diào)控VSV或IFN-Ⅰ刺激的ISGs的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞和小鼠對病毒的抵抗能力。通過相互作用質(zhì)譜及泛素化修飾定量質(zhì)譜，鑒定了15個RNF2在抗病毒反應(yīng)中的潛在底物，其中包括轉(zhuǎn)錄因子STAT1，同時還鑒定到了STAT1上可能受RNF2調(diào)控的12個潛在賴氨酸位點。通過免疫沉淀和體外GST pull down的方法，證明了RNF2與STAT1的直接相互作用，并且通過轉(zhuǎn)

6、染一系列的RNF2或STAT1截短體，泛素分子突變體后進(jìn)行免疫沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)RNF2主要通過其RING結(jié)構(gòu)域增強IFN-Ⅰ刺激下STAT1的K33位連接的多聚泛素化修飾，并抑制了STAT1介導(dǎo)的啟動子序列ISRE的轉(zhuǎn)錄活性。在機制的研究中，利用染色質(zhì)免疫沉淀，體外的DNA pull down等實驗發(fā)現(xiàn)RNF2并不影響IFN-I/STAT1信號通路的激活，而是通過修飾STAT1的DNA結(jié)合區(qū)域的K379位點促進(jìn)STAT1與DNA的解離，間

7、接促進(jìn)其發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，從而及時抑制IFN-I/STAT1信號。
　　研究不僅系統(tǒng)性地解析了RING E3分子在抗病毒天然免疫領(lǐng)域內(nèi)的調(diào)控功能，還發(fā)現(xiàn)了一系列抗病毒天然免疫反應(yīng)的新的調(diào)控分子，更為IFN-I/STAT1信號通路的負(fù)向調(diào)控提供了新的機制。因此，研究結(jié)果具有臨床指導(dǎo)和轉(zhuǎn)化價值，不僅為治療病毒感染提供了新的潛在靶點和思路，為新的抗病毒藥物的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，也為增強IFN-Ⅰ的治療效果，防止IFN-Ⅰ過度活化或長期應(yīng)