Klotho在RIG-I介導(dǎo)的抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)又稱固有免疫系統(tǒng)，在識(shí)別病毒感染、觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大和誘導(dǎo)I型干擾素及炎癥反應(yīng)等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)過(guò)程中起著決定性作用。抗病毒天然免疫系統(tǒng)中有兩種模式識(shí)別受體負(fù)責(zé)結(jié)合病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的雙鏈RNA：一種是定位于細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)吞泡膜上面的Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)，能夠通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子（interferonregulatoryfactor3,IRF-3）和核因子-κB(nucl

2、earfactor-κB,NF-κB)，誘導(dǎo)I型干擾素和炎癥因子的產(chǎn)生。另一種是定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可識(shí)別病毒雙鏈RNA的解旋酶受體維甲酸誘導(dǎo)基因I樣受體(RIG-Ilikereceptors,RLRs)。維甲酸誘導(dǎo)基因I(RetinoicacidinduciblegeneI,RIG-I)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的該家族的受體成員，在除漿細(xì)胞以外的幾乎所有細(xì)胞中都能發(fā)揮作用。RIG-I識(shí)別不同種類的RNA，激活抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)通路，活化轉(zhuǎn)錄因子IRF-3

3、和NF-κB，最終誘導(dǎo)干擾素β（interferon-β,IFN-β）的合成。
　　Klotho是一種抗衰老蛋白，其基因缺失表現(xiàn)一系列衰老癥狀。近年來(lái)有報(bào)道Klotho在固有免疫中發(fā)揮作用，其與I型干擾素和白介素等抗病毒因子間存在聯(lián)系。然而，Klotho是否參與細(xì)胞抗病毒固有免疫很少受到關(guān)注?；诖?，我們對(duì)Klotho在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用進(jìn)行初步探索，為尋找和開(kāi)發(fā)新型調(diào)節(jié)固有免疫的生物大分子奠定基礎(chǔ)。
　　為探討Kl

4、otho在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用，本研究首先觀察了Klotho對(duì)病毒入侵后干擾素表達(dá)的影響，并初步探討了其在RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路中的作用及其作用方式。主要研究?jī)?nèi)容及研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)基因轉(zhuǎn)染和RNA干涉技術(shù)過(guò)表達(dá)和干涉Klotho基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)病毒入侵后干擾素的表達(dá)具有正向調(diào)控作用。
　　2.通過(guò)在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PolyI:C模擬細(xì)胞內(nèi)的病毒刺激，證實(shí)了Klotho能通過(guò)胞內(nèi)途徑增強(qiáng)RIG-I

5、介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路，進(jìn)一步通過(guò)將該抗病毒通路中信號(hào)因子△RIG-I、MAVS、TRAF、TBKI、IKKε表達(dá)質(zhì)粒分別與Klotho表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Klotho能通過(guò)影響“病毒感受器”RIG-I及其下游接頭蛋白—線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（mitochondrialantiviralsignalingprotein,MAVS），特異性增強(qiáng)RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路。
　　3.分別將野生型Klotho和缺失信號(hào)肽的突

6、變體Kl△ss質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，病毒刺激或PolyI:C模擬胞內(nèi)刺激條件下，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β報(bào)告基因的活性，熒光定量RT-PCR和ELISA檢測(cè)IFN-β的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失信號(hào)肽的Klotho即胞內(nèi)Klotho蛋白不能誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)。相反，外加Klotho蛋白或?qū)⑦^(guò)表達(dá)Klotho的培養(yǎng)基上清（即具有生物活性的Klotho蛋白）加入到RIG-I信號(hào)通路已被激活的培養(yǎng)基中，干擾素的表達(dá)明顯上調(diào)；而當(dāng)細(xì)胞外的Klo