人類新發(fā)NL63冠狀病毒木瓜樣蛋白酶調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其分子機制.pdf

1、宿主免疫系統(tǒng)分為天然免疫(Innate immunity)和獲得性免疫(Adaptiveimmunity)。天然免疫是非特異形式的免疫應(yīng)答，是以識別和清除病原體為主的第一道防御屏障。天然免疫反應(yīng)主要發(fā)生在病毒感染的早期且與抗病毒感染緊密相關(guān)。病毒入侵后，宿主會立即啟動天然免疫應(yīng)答，通過細胞表面及細胞質(zhì)中的模式識別受體(PRR)檢測各種病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，例如病毒RNA，細菌細胞壁成分等，啟動一系列的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)?；罨?/p>

2、的模式識別受體通過同型互作與銜接蛋白相接，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中通過磷酸化及泛素化修飾激活信號通路中一些重要的基因，誘導(dǎo)蛋白激酶(如IKKβ-IKKα-IKKγ和TBK1/IKKe激酶復(fù)合體)的活化，從而激活轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB，IRF7，IRF3)，最終引發(fā)促炎癥細胞因子及Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄，共同介導(dǎo)抗病毒效應(yīng)。
　　 冠狀病毒是一類擁有龐大RNA基因組的包膜病毒。至今發(fā)現(xiàn)的人類冠狀病毒包括HCoV-229E、HCo

3、V-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63和HcoV-HKU1五種，其中NL63和HKU1是繼SARS冠狀病毒后出現(xiàn)的兩種人類新發(fā)冠狀病毒。NL63冠狀病毒是2004年由荷蘭學(xué)者Van der Hoek L首先報道的一種單股正鏈RNA病毒，呈世界性分布，流行病學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，NL63冠狀病毒在兒童和成人(特別是兒童)呼吸道感染中的陽性檢測率高，已成為人類呼吸道感染的主要新發(fā)病原之一。
　　 冠狀病毒與宿主間的相互作用決定了其

4、致病性和免疫特性。冠狀病毒感染宿主后會立即啟動抗病毒天然免疫反應(yīng)，病毒為了躲避宿主機體復(fù)雜的防御體系，必然對宿主細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行干預(yù)和調(diào)節(jié)。近年來，越來越多的研究表明，病毒通過編碼多種功能蛋白調(diào)控宿主的抗病毒天然免疫反應(yīng)。例如，小核糖核酸病毒編碼的3C蛋白酶一方面剪切復(fù)制聚合酶前體，另一方面抑制RIG-I和NF-KB的活化。我們前期研究表明，NL63冠狀病毒nsp3編碼的木瓜樣蛋白酶(PLP)包括兩個核心結(jié)構(gòu)域PLP1和PLP2。通

5、過體內(nèi)DUB活性分析發(fā)現(xiàn)，只有PLP2核心結(jié)構(gòu)域具有DUB活性，而PLP1則沒有。PLP2作為一種干擾素拮抗劑，通過去除RIG-Ⅰ和STING的泛素化修飾，負調(diào)節(jié)干擾素表達，而且PLP2的DUB活性與其干擾素拮抗作用是相互獨立的。由于編碼PLP2的nsp3位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上，因此NL63冠狀病毒nsp3編碼的木瓜樣蛋白酶應(yīng)該是膜定位的。目人類新發(fā)NL63冠狀病毒木瓜樣蛋白酶調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其分子機制前對于NL63冠狀

6、病毒編碼的木瓜樣蛋白酶(PLP)調(diào)控宿主的抗病毒天然免疫反應(yīng)機制，以及可溶性木瓜樣蛋白酶(PLP2)與膜定位的木瓜樣蛋白酶(PLP2-TM)之間的差異性尚不清楚。圍繞這一問題我們針對NL63冠狀病毒編碼的膜定位木瓜樣蛋白酶(PLP-TM)進行更加深入的研究，主要結(jié)果如下：
　　 一.NL63冠狀病毒編碼的木瓜樣蛋白酶(PLP)在細胞內(nèi)的定位研究
　　 (一)利用分子克隆及基因定點突變技術(shù)，分別構(gòu)建PLP1-TM，PLP2

7、-TM的重組體及蛋白酶活性催化位點突變體(PLP1-TM C1062A，PLP1-TM H1212A，PLP1-TM D1225A，PLP2-TM C1678A，PLP2-TM H1836A，PLP2-TM D1489A)。
　　 (二)對NL63 PLP蛋白酶進行進行免疫熒光染色，確定了nsp3編碼的可溶性PLP和膜定位的PLP-TM在細胞的定位情況。結(jié)果表明膜定位前后蛋白表達位置發(fā)生改變，PLP均勻的分布于細胞質(zhì)中，而PLP

8、-TM則集中分布于核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。同時，我們通過western blot檢測到PLP-TM及酶活性突變體的表達條帶。
　　 二.PLP-TM的生物學(xué)特性研究
　　 (一)利用DUB檢測技術(shù)對NL63 PLP的去泛素化活性進行分析，發(fā)現(xiàn)PLP1-TM和PLP2-TM具有明顯的DUB活性，證實PLP具有TM依賴的DUB活性；同時，PLP2-TM的蛋白酶催化活性位點(C，H，D)突變后，其DUB活性降低，其中C1678A和H18

9、36的對野生型PLP2-TM的DUB活性影響較大，而D1849A沒有影響。說明PLP2-TM的DUB活性不完全依賴其蛋白酶的催化活性。
　　 (二)利用DUB和去ISG檢測技術(shù)對NL63 PLP的底物特異性進行研究，發(fā)現(xiàn)PLP2-TM對Ub-K48和Ub-K63連接的多聚泛素化沒有表現(xiàn)出特異性；其次，以類泛素分子(SUMO和ISG15)為作用底物，發(fā)現(xiàn)PLP2和PLP2-TM均具有去ISG活性，然而只有膜定位的PLP(PLP1-

10、TM和PLP2-TM)具有去SUMO活性，說明膜定位對于NL63冠狀病毒編碼木瓜樣蛋白酶的功能發(fā)揮具有重要作用。
　　 三.PLP-TM負調(diào)控宿主干擾素表達活性研究
　　 (一)利用雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)對PLP-TM干擾素拮抗活性進行分析，發(fā)現(xiàn)PLP1-TM和PLP2-TM可以下調(diào)外界條件(仙臺病毒，RIG-IN等)刺激下Ⅰ型干擾素的表達。說明膜定位木瓜樣蛋白酶(PLP-TM)是一種干擾素拮抗劑而且PLP2-TM的

11、拮抗活性強于PLP1-TM。
　　 (二)對PLP2-TM干擾拮抗活性的特異性進行研究，證實PLP2-TM負調(diào)節(jié)干擾素表達的作用具有劑量依賴性，而且PLP2-TM的三種蛋白酶活性突變體(PLP2-TM C1678A，PLP2-TM H1836A，PLP2-TM D1489A)均能抑制干擾素產(chǎn)生，且存在劑量效應(yīng)。說明PLP2-TM的干擾素拮抗活性是獨立于蛋白酶活性之人類新發(fā)NL63冠狀病毒木瓜樣蛋白酶調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)及其

12、分子機制外的一種特異性功能。
　　 四.PLP2-TM負調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)分子機制研究
　　 (一)首先，利用干擾素表達通路中重要調(diào)節(jié)蛋白激活干擾素表達，同時瞬轉(zhuǎn)PLP2-TM后檢測PLP2-TM對信號蛋白介導(dǎo)的干擾素表達通路的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示PLP2-TM及其突變體明顯抑制由RIG-I/TRAF3/TBK1/IRF3激活的干擾素的產(chǎn)生；說明PLP2-TM干擾素拮抗活性不依賴其蛋白酶催化活性；其次，通過免疫共沉

13、淀技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)PLP2-TM通過去除RIG-I/TRAF3/TBK1/IRF3的泛素化或ISG化修飾負調(diào)控干擾素表達通路。
　　 (二)首先，利用免疫共沉淀技術(shù)，對最新發(fā)現(xiàn)的干擾素刺激因子STING上下游信號蛋白之間的相互作用進行檢測，發(fā)現(xiàn)PLP2-TM能夠破壞STING與IPS-1間的相互作用，但是不破壞STING與TRAF3，STING與TBK1，IPS-1與TRAF3間的相互作用。說明PLP2-TM阻斷了信號由IPS-1

14、向STING的流動，以及STING向下游蛋白分子的傳遞；其次，我們對STING與蛋白激酶間的相互作用進行檢測，發(fā)現(xiàn)PLP2-TM能夠破壞STING與IKKε間的相互作用，但是PLP2-TM不能破壞STING與TBK1間以及TBK1與IRF3間的相互作用，說明PLP2-TM特異性的阻止了STING募集蛋白激酶IKKε至IPS-1，抑制IRF3的活化。
　　 (三)首先，利用免疫共沉淀技術(shù)對STING的泛素化及ISG化進行檢測，發(fā)現(xiàn)

15、PLP2-TM能夠破壞STING的泛素化修飾和ISG化修飾；其次，二聚化是STING激活干擾素表達的一個必要條件，而且STING的泛素化和ISG化是在其二聚化基礎(chǔ)上進行的，所用利用不同標簽的STING進行IP分析，發(fā)現(xiàn)PLP2-TM能夠破壞STING的二聚化從而抑制IRF3介導(dǎo)的干擾素表達通路。
　　 本課題研究從多方面多角度闡明了PLP2-TM調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)機制。實驗闡明了NL63編碼的木瓜樣蛋白酶(PLP)是一種

16、多功能蛋白酶，除了經(jīng)典的蛋白酶水解活性，還具有TM依賴的去泛素化酶(DUB)活性，同時又作為一種高效的干擾素拮抗劑負調(diào)控宿主的抗病毒天然免疫反應(yīng)。NL63編碼PLP2-TM調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)機制研究表明，一方面，PLP2-TM通過DUB活性，去除信號通路中重要調(diào)節(jié)蛋白的泛素化活性，負調(diào)控干擾素表達；另一方面，PLP2-TM能夠破壞最新發(fā)現(xiàn)的干擾素刺激因子STING與IPS-1間，STING與IKKε間的相互作用，阻止信號由STI

17、NG流向TRAF3和IKKε，從而阻礙了轉(zhuǎn)錄因子IRF3的活化，最終抑制Ⅰ型干擾素的表達。重要的是，我們首次證實PLP2-TM通過破壞STING的二聚化抑制STING的干擾素激活作用，為病毒調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)機制研究提供有力參考資料。綜上所述，NL63冠狀病毒充分利用木瓜樣蛋白酶PLP2-TM的多樣化功能，負調(diào)控天然免疫反應(yīng)。值得注意的是，NL63編碼多功能木瓜樣蛋白酶的每種活性之間既相互獨立又相互聯(lián)系，共同維持病毒的復(fù)制和釋放