人冠狀病毒NL63棘突蛋白不同片段的表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、背景：
　　 人冠狀病毒NL63是2004年發(fā)現(xiàn)的一種新的冠狀病毒，與HCoV-229E同屬于I組冠狀病毒。其引起的呼吸道疾病需要住院治療，特別是兒童、老人及免疫功能低下的成人。而且HCoV-NL63還報(bào)道與哮喘及Kawasaki疾病有關(guān)。中和抗體或者T細(xì)胞免疫反應(yīng)被認(rèn)為直接針對(duì)HCoV-NL63的多種蛋白，但是主要仍是棘突蛋白，所以人們認(rèn)為棘突蛋白介導(dǎo)的特異的免疫反應(yīng)在抵御其感染中起著很重要的作用。另外，棘突蛋白包含受體結(jié)合區(qū)

2、，參與病毒的結(jié)合與進(jìn)入，所以在疫苗的研究及診斷治療的發(fā)展方面提供了重要的靶位。然而目前對(duì)HCoV-NL63棘突蛋白的表達(dá)與功能分析的報(bào)道仍十分有限，對(duì)其抗原性與免疫原性的研究仍有待深入。
　　 痘苗病毒是一種雙鏈的DNA病毒，基因組全長(zhǎng)大約180kb。痘苗病毒天壇株在五十多年前就被成功的用于消滅天花，并且極少出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。通過(guò)同源重組的方法可以將較長(zhǎng)的DNA片段插入痘苗病毒基因組而不破壞病毒的整合。痘苗病毒載體己經(jīng)用于多種病

3、原體的糖蛋白表達(dá)及功能分析，亦可直接應(yīng)用于診斷抗原的制備及疫苗的研發(fā)。
　　 方法：
　　 一、采用pVRC真核表達(dá)載體構(gòu)建了攜帶冠狀病毒NL63棘突蛋白四個(gè)片段的表達(dá)質(zhì)粒，將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T，24-48h后收獲細(xì)胞，進(jìn)行Westernblot及免疫熒光分析證實(shí)并比較其表達(dá)情況。
　　 二、采用pJSC1175痘苗病毒表達(dá)載體，構(gòu)建了攜帶冠狀病毒NL63棘突蛋白四個(gè)片段的表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)同源重組獲得重組的痘苗病

4、毒，感染143細(xì)胞，收獲感染細(xì)胞超聲裂解獲得病毒，利用Westernblot及免疫熒光方法證實(shí)并比較其表達(dá)。
　　 三、用真核表達(dá)質(zhì)粒及痘苗病毒分別單獨(dú)免疫及聯(lián)合免疫小鼠，最后一次免疫后三周分離脾細(xì)胞，通過(guò)ELISPOT對(duì)細(xì)胞免疫水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 一、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段在pVRC8301真核表達(dá)載體中的表達(dá)
　　 根據(jù)生物信息學(xué)及文獻(xiàn)資料將S蛋白分段，構(gòu)建分別表達(dá)S1（S蛋

5、白的S1區(qū)前面加信號(hào)肽1-20aa，簡(jiǎn)稱S1）、S2(S蛋白的S2片段去掉跨膜區(qū)，在其前面加信號(hào)肽1-20aa，簡(jiǎn)稱S2)、RL(S蛋白的受體結(jié)合區(qū)前面加信號(hào)肽1-20aa,簡(jiǎn)稱RL)、RS(S蛋白的最佳受體結(jié)合區(qū)前面加信號(hào)肽1-20aa,簡(jiǎn)稱RS)四個(gè)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，四個(gè)質(zhì)粒分別命名為pVRC8301-S1、pVRC8301-S2、pVRC8301-RL及pVRC8301-RS。將四個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，24-48h后收集

6、細(xì)胞，經(jīng)Westernblot及免疫熒光驗(yàn)證其在細(xì)胞內(nèi)均能正確有效表達(dá)。
　　 二、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段的重組痘苗病毒的制備及表達(dá)
　　 根據(jù)生物信息學(xué)及文獻(xiàn)資料將S蛋白分段，構(gòu)建分別表達(dá)S1（S蛋白的S1區(qū)前面加信號(hào)肽1-20aa,簡(jiǎn)稱S1）、S2(S蛋白的S2區(qū)去掉跨膜區(qū)，在其前面加信號(hào)肽1-20aa,簡(jiǎn)稱S2)、RL(S蛋白的受體結(jié)合區(qū)前面加信號(hào)肽1-20aa，簡(jiǎn)稱RL)、RS(S蛋白的最佳受體結(jié)合區(qū)前

7、面加信號(hào)肽1-20aa，簡(jiǎn)稱RS)四個(gè)基因的重組痘苗病毒質(zhì)粒，通過(guò)同源重組獲得相應(yīng)的痘苗病毒分別命名為RVJ1175-S1、RVJ1175-S2、RVJ1175-RL、RVJ1175-RS。利用產(chǎn)物測(cè)序的方法證實(shí)：表達(dá)各S片段的重組痘苗病毒中，目的基因重組于TK區(qū)并位于7.5k啟動(dòng)子下游。Westernblot、免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，S蛋白各片段均可在143細(xì)胞中很好的表達(dá)，并且S1，RL及RS的蛋白熒光主要位于細(xì)胞膜上，而S2的蛋白熒

8、光則主要分布在細(xì)胞漿。
　　 三、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段的免疫原性研究
　　 將各表達(dá)質(zhì)粒及重組痘苗病毒免疫BalB/C小鼠，分為三組：第一組四種pVRC8301質(zhì)粒按照10ug/只小鼠，皮內(nèi)注射加電轉(zhuǎn)免疫小鼠三次；第二組四種pVRC8301質(zhì)粒按照10ug/只小鼠，皮內(nèi)注射加電轉(zhuǎn)免疫小鼠兩次，重組痘苗病毒按107PFU/只小鼠經(jīng)腹腔加強(qiáng)；第三組四種重組痘苗病毒按107PFU/只小鼠經(jīng)腹腔免疫兩次，間隔四周免疫

9、，最后一次免疫后三周分離脾細(xì)胞，ELISPOT檢測(cè)分析小鼠的細(xì)胞免疫。結(jié)果顯示，質(zhì)粒與痘苗聯(lián)合免疫組的細(xì)胞免疫反應(yīng)較其他兩組均強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 一、成功構(gòu)建了以pVRC8301為載體的兩組共8個(gè)DNA疫苗質(zhì)粒。利用免疫熒光、Westernblot等方法證實(shí)各S蛋白片段均可在293T細(xì)胞中很好的表達(dá)。
　　 二、成功構(gòu)建了四種痘苗病毒質(zhì)粒，并通過(guò)同源重組的方法獲得四種重組痘苗病毒。利用免疫熒光，Wester