產(chǎn)氣莢膜酸菌β、ε毒素不同片段的融合表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)屬梭狀芽孢桿菌屬,是一種重要的人獸共患病病原。該病的防控主要依賴于疫苗的免疫接種,現(xiàn)有的疫苗由全菌及類毒素滅活制備,存在注射劑量大、家畜接種局部反應(yīng)較重等問題。鑒于以上原因,本試驗(yàn)試圖融合表達(dá)β、ε毒素不同片段,并將表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔,通過(guò)攻毒保護(hù)和血清中和試驗(yàn)比較其免疫原性,從而篩選出可提供足夠免疫保護(hù)的毒素片段,以制備含有兩種毒素保護(hù)性抗原的融合蛋白,為今后多價(jià)基因工

2、程類毒素疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。
　　 為分析β,ε毒素不同截短片段的免疫原性,通過(guò)DNAstar軟件分析兩毒素蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),根據(jù)親水性基團(tuán)的分布,截取毒素成熟肽序列上不同片段,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得三個(gè)不同組合的融合基因并克隆入pET-32a(+)載體中,誘導(dǎo)表達(dá)得到三個(gè)重組融合蛋白,分別命名為ε1～432～β1-610、β419～927-ε430～889、β-ε。分別將融合蛋白以1mg/只的劑量免疫家兔,首免后14天以相同劑

3、量加強(qiáng)免疫一次。分別測(cè)定首免后14天,二免后7天家兔血清的中和抗體效價(jià),并于二免7天后分別以1MLD的產(chǎn)氣莢膜梭菌C型毒素,D型毒素進(jìn)行攻毒試驗(yàn),測(cè)定攻毒保護(hù)結(jié)果。結(jié)果表明:對(duì)C型毒素,ε1-432-β1～610、β419～927-ε430-889、β-ε的一免血清均不能中和C型毒素,二免血清中只有β-ε免疫動(dòng)物可中和1MLD的C型毒素,攻毒保護(hù)結(jié)果分別為0/4、0/4、2/4,由此推測(cè)β毒素的免疫保護(hù)性依賴于毒素全長(zhǎng)的完整性。對(duì)D型毒

4、素,ε1～432=β1～610、β419～927-ε430～889、β-ε的一免血清中和效價(jià)分別為4,1,40,二免血清中和效價(jià)分別為80,1、160,攻毒保護(hù)結(jié)果為4/4、1/4,4/4,由此推測(cè)ε,ε1～432均可提供有效保護(hù),而ε430～889免疫原性弱,不能提供有效保護(hù),表明ε毒素的主要保護(hù)性抗原位于N端的ε1-432區(qū)域內(nèi)。
　　 根據(jù)以上結(jié)果,構(gòu)建了ε1-432-β融合基因并獲得表達(dá)。將獲得的ε1～432-β融合蛋白

5、以0.1mg/只劑量免疫家兔,首免后14天加強(qiáng)免疫一次,測(cè)定血清中和效價(jià)及免疫攻毒結(jié)果。結(jié)果表明:對(duì)C型毒素,ε1～432=β0.1mg/只免疫組一免血清中和效價(jià)為0,二免血清中和效價(jià)為16,攻毒保護(hù)結(jié)果為3/3。對(duì)D型毒素,一免血清中和效價(jià)為0,二免血清中和效價(jià)為0,攻毒保護(hù)結(jié)果為3/3。
　　 結(jié)果表明,ε1～432-β融合蛋白可對(duì)β毒素提供足夠保護(hù),而對(duì)ε毒素不能保護(hù),這與ε1～432-β1～610可對(duì)ε毒素提供保護(hù)的結(jié)果

6、相矛盾。初步推測(cè)為毒素片段免疫原性的強(qiáng)弱主要依賴于其表位構(gòu)象。當(dāng)毒素表達(dá)蛋白越接近于其天然構(gòu)象時(shí),免疫原性越強(qiáng),反之越弱。從ε1-432-β1-610到ε1～432-β,ε1-432片段的免疫原性于后者大為減低甚至喪失,推測(cè)當(dāng)ε1～432與片段較大的β融合時(shí),其表位構(gòu)象較大受到β毒素影響,故免疫原性變?nèi)?。比較β-ε到ε1～432-β,β片段的免疫原性也有明顯增強(qiáng),推測(cè)是由于ε1～432片段較小,對(duì)其表位構(gòu)象的抑制作用也較小。這一推論有待