林蛙嗜水氣單胞菌氣溶素基因原核表達(dá)及免疫原性的初步分析.pdf

1、林蛙“紅腿病”是危害林蛙養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一，該病傳播快、死亡率高，對(duì)林蛙的養(yǎng)殖業(yè)的危害嚴(yán)重。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，AH)是林蛙“紅腿病”的主要致病菌。該菌的致病力與毒力因子關(guān)系密切，尤其是氣溶素（Aer）。氣溶素由463個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為51.5 ku，是嗜水氣單胞菌主要的毒力因子之一，具有溶血性、細(xì)胞毒性和腸毒性。該菌的血清型多，在不同的地區(qū)、不同的宿主都有所差異，這對(duì)滅活苗的使用造成了很大的

2、限制。找出不同血清型菌株共同的保護(hù)性抗原，研制出新型亞單位疫苗是現(xiàn)在研究的迫切需求。
　　本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上報(bào)道的嗜水氣單胞菌氣溶素基因序列（NCBI登錄號(hào)：DQ186611），針對(duì)該基因的保守區(qū)，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增氣溶素基因的特異性引物，以從林蛙體內(nèi)分離的嗜水氣單胞菌基因組DNA為模版，用PCR方法擴(kuò)增目的片段，將該基因克隆pMDl8-T載體上，經(jīng)PCR、酶切及序列測(cè)定的鑒定和分析，結(jié)果表明成功地克隆了1163 bp的林蛙嗜

3、水氣單胞菌氣溶素基因，對(duì)所克隆的氣溶素基因序列與基因庫(kù)中已發(fā)表的DQ186611進(jìn)行比較分析同源性高達(dá)99％。再將該基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，經(jīng)PCR鑒定及酶切鑒定，證明成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pGEX-Aer。將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體，經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)過(guò)8 h表達(dá)量達(dá)到最高。該融合蛋白 pGEX-Aer的分子量約為69 ku，表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在。經(jīng)Weste