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文檔簡介
1、豬支原體肺炎(MPS)又稱豬氣喘病,是由豬肺炎支原體(MHP)引起的,感染豬以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病。豬群在感染MHP后,很容易繼發(fā)感染其他病原,增加了豬病診斷和預防控制的難度。此外,MPS會導致感染豬群的飼料轉化率降低,增重減緩,嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。同其他傳染病的防治一樣,MPS的控制也主要采取免疫接種的方式。目前預防MPS的商用疫苗主要是常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗。但是豬肺炎支原體的培養(yǎng)條件苛刻,制備滅活疫苗或弱毒
2、疫苗的成本相對較高。因此,迫切需要研制出更為安全、高效、廉價的新型疫苗。挖掘豬肺炎支原體抗原蛋白,是開發(fā)新型豬肺炎支原體疫苗的關鍵。豬肺炎支原體的細胞膜在其致病過程中發(fā)揮著重要作用,而目前MHP的膜蛋白中有很大部分蛋白的功能是未知的。鑒于此,本課題以豬肺炎支原體為研究對象,對其膜蛋白中具有免疫原性的蛋白進行了篩選,旨在找到豬肺炎支原體的免疫優(yōu)勢蛋白,從而為開發(fā)亞單位疫苗和建立診斷方法奠定基礎。具體研究內容如下:
1.候選蛋
3、白的確定運用生物信息學方法預測并分析了豬肺炎支原體168株全基因組695個CDS和目前已知的MHP免疫原性蛋白的特性,發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體已知免疫原性蛋白中,粘附蛋白P97,P102,P216和抗原蛋白P46,P65,P95均只有一個跨膜區(qū),并且跨膜區(qū)位于蛋白的N端,而蛋白的C端暴露在膜外。綜合考慮蛋白的大小和進行密碼子突變的可操作性,選定了34個只有一個跨膜區(qū)且跨膜區(qū)在N端的膜蛋白為研究對象。
2.候選蛋白的原核表達通過對3
4、4個候選蛋白基因的分析,發(fā)現(xiàn)其中30個基因中存在TGA編碼色氨酸的現(xiàn)象,通過SOE-PCR將這30個基因中編碼色氨酸的TGA突變?yōu)榱舜竽c桿菌中編碼色氨酸的TGG,并將突變后的30個基因和不需要突變的4個基因分別克隆到原核表達載體pET28a中成功構建了各基因的原核表達質粒。將構建的表達質粒分別轉化至BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞,經IPTG誘導后,SDS-PAGE證實其中26個候選蛋白獲得高效表達。
5、 3.候選蛋白的反應原性分析以MHP人工感染28天豬陽性血清作為一抗,通過菌落原位免疫印跡和WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)34個候選蛋白中MHP168_322,MHP168_347,MHP168_348,MHP168_398,MHP168_622和MHP168_639這6個蛋白能與MHP感染豬陽性血清發(fā)生特異反應。進一步以MHP感染28天的豬陽性血清(n=27)和MHP滅活疫苗和弱毒疫苗免疫后不同時間的豬血清分別作為一抗,間接ELISA
6、檢測純化的候選蛋白MHP168_347,MHP168_348,MHP168_622,MHP168_639和陽性對照P46蛋白與血清反應的情況。結果顯示,候選蛋白MHP168_347,MHP168_348,MHP168_639和P46蛋白均能與MHP人工感染28天的豬陽性血清反應,同陰性血清對照的結果相比,差異極顯著。MHP168_622與MHP人工感染28天的豬陽性血清和陰性血清反應均很強烈,無顯著差異。MHP168_347,MHP16
7、8_348,MHP168_639和陽性對照P46蛋白均能與不同時期的弱毒疫苗免疫豬血清發(fā)生較強的反應,與PBS對照組相比,差異顯著,其中MHP168348的反應最強烈,可能是一個重要的保護性抗原。這4個蛋白均不與滅活疫苗免疫血清發(fā)生反應。
4.候選蛋白的免疫原性分析將純化的候選蛋白MHP168_347,MHP168_348,MHP168_622和MHP168_639和陽性對照P46蛋白免疫雌性BALB/c小鼠。以純化的候選
8、蛋白和4種豬肺炎支原體(N-1株,X-1株,MHP168株F116代和F374代)的菌體蛋白分別作抗原,通過間接ELISA和Western Blot檢測候選蛋白免疫小鼠的血清抗體水平。結果顯示:候選蛋白MHP168_639,MHP168_347和陽性對照P46蛋白均能誘導免疫小鼠產生較高水平的抗體,免疫原性較好。但只有MHP168639免疫的小鼠血清能與體外培養(yǎng)的豬肺炎支原體菌體蛋白發(fā)生特異性反應。
本課題首次分析了豬肺炎
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