豬肺炎支原體表面膜蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、豬支原體肺炎（MPS）又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（MHP）引起的，感染豬以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病。豬群在感染MHP后，很容易繼發(fā)感染其他病原，增加了豬病診斷和預(yù)防控制的難度。此外，MPS會導(dǎo)致感染豬群的飼料轉(zhuǎn)化率降低，增重減緩，嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。同其他傳染病的防治一樣，MPS的控制也主要采取免疫接種的方式。目前預(yù)防MPS的商用疫苗主要是常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗。但是豬肺炎支原體的培養(yǎng)條件苛刻，制備滅活疫苗或弱毒

2、疫苗的成本相對較高。因此，迫切需要研制出更為安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗。挖掘豬肺炎支原體抗原蛋白，是開發(fā)新型豬肺炎支原體疫苗的關(guān)鍵。豬肺炎支原體的細(xì)胞膜在其致病過程中發(fā)揮著重要作用，而目前MHP的膜蛋白中有很大部分蛋白的功能是未知的。鑒于此，本課題以豬肺炎支原體為研究對象，對其膜蛋白中具有免疫原性的蛋白進(jìn)行了篩選，旨在找到豬肺炎支原體的免疫優(yōu)勢蛋白，從而為開發(fā)亞單位疫苗和建立診斷方法奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　 1.候選蛋

3、白的確定運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測并分析了豬肺炎支原體168株全基因組695個(gè)CDS和目前已知的MHP免疫原性蛋白的特性，發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體已知免疫原性蛋白中，粘附蛋白P97，P102，P216和抗原蛋白P46，P65，P95均只有一個(gè)跨膜區(qū)，并且跨膜區(qū)位于蛋白的N端，而蛋白的C端暴露在膜外。綜合考慮蛋白的大小和進(jìn)行密碼子突變的可操作性，選定了34個(gè)只有一個(gè)跨膜區(qū)且跨膜區(qū)在N端的膜蛋白為研究對象。
　　 2.候選蛋白的原核表達(dá)通過對3

4、4個(gè)候選蛋白基因的分析，發(fā)現(xiàn)其中30個(gè)基因中存在TGA編碼色氨酸的現(xiàn)象，通過SOE-PCR將這30個(gè)基因中編碼色氨酸的TGA突變?yōu)榱舜竽c桿菌中編碼色氨酸的TGG，并將突變后的30個(gè)基因和不需要突變的4個(gè)基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET28a中成功構(gòu)建了各基因的原核表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE證實(shí)其中26個(gè)候選蛋白獲得高效表達(dá)。
　　

5、 3.候選蛋白的反應(yīng)原性分析以MHP人工感染28天豬陽性血清作為一抗，通過菌落原位免疫印跡和WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)34個(gè)候選蛋白中MHP168_322，MHP168_347，MHP168_348，MHP168_398，MHP168_622和MHP168_639這6個(gè)蛋白能與MHP感染豬陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。進(jìn)一步以MHP感染28天的豬陽性血清(n=27)和MHP滅活疫苗和弱毒疫苗免疫后不同時(shí)間的豬血清分別作為一抗，間接ELISA

6、檢測純化的候選蛋白MHP168_347，MHP168_348，MHP168_622，MHP168_639和陽性對照P46蛋白與血清反應(yīng)的情況。結(jié)果顯示，候選蛋白MHP168_347，MHP168_348，MHP168_639和P46蛋白均能與MHP人工感染28天的豬陽性血清反應(yīng)，同陰性血清對照的結(jié)果相比，差異極顯著。MHP168_622與MHP人工感染28天的豬陽性血清和陰性血清反應(yīng)均很強(qiáng)烈，無顯著差異。MHP168_347，MHP16

7、8_348，MHP168_639和陽性對照P46蛋白均能與不同時(shí)期的弱毒疫苗免疫豬血清發(fā)生較強(qiáng)的反應(yīng)，與PBS對照組相比，差異顯著，其中MHP168348的反應(yīng)最強(qiáng)烈，可能是一個(gè)重要的保護(hù)性抗原。這4個(gè)蛋白均不與滅活疫苗免疫血清發(fā)生反應(yīng)。
　　 4.候選蛋白的免疫原性分析將純化的候選蛋白MHP168_347，MHP168_348，MHP168_622和MHP168_639和陽性對照P46蛋白免疫雌性BALB/c小鼠。以純化的候選

8、蛋白和4種豬肺炎支原體(N-1株，X-1株，MHP168株F116代和F374代)的菌體蛋白分別作抗原，通過間接ELISA和Western Blot檢測候選蛋白免疫小鼠的血清抗體水平。結(jié)果顯示:候選蛋白MHP168_639，MHP168_347和陽性對照P46蛋白均能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體，免疫原性較好。但只有MHP168639免疫的小鼠血清能與體外培養(yǎng)的豬肺炎支原體菌體蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 本課題首次分析了豬肺炎