綿羊肺炎支原體溶血素蛋白的原核表達(dá)與免疫學(xué)特性的研究.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae.MO)是一種高度接觸性傳染病，在世界上流行范圍極大，可以造成綿羊和山羊的傳染性胸膜肺炎。由于支原體生物結(jié)構(gòu)上的特殊性，導(dǎo)致大部分的抗生素類藥物對(duì)其無效。因?yàn)橹гw的人工培養(yǎng)難度較大，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，從而使其在傳統(tǒng)疫苗研究工作上也進(jìn)展緩慢。隨著生物化學(xué)和生物工程信息技術(shù)的發(fā)展，人們開始著重于研究新型的疫苗。
　　本實(shí)驗(yàn)從綿羊肺炎支原體的全基因組開始，通過綿羊肺炎支原體培養(yǎng)

2、過程中的溶血現(xiàn)象。來進(jìn)行溶血素蛋白基因的克隆，并且通過原核表達(dá)來研究其蛋白的活性。首先在基因片段的克隆上，由于TGA在大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)中為終止密碼子，通過定點(diǎn)突變的方法將綿羊肺炎支原體的溶血素(hemolysin)基因上面的TGA突變?yōu)門GG，使克隆后的基因片段在大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)中與在支原體的表達(dá)系統(tǒng)中相一致。將克隆好的基因片段與PET32a質(zhì)粒進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)入可以大量表達(dá)蛋白的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過對(duì)誘導(dǎo)條件的研究，經(jīng)過SDS

3、-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)證明，可以表達(dá)出正確的目的蛋白，其大小為44.5kDa,將經(jīng)過純化的蛋白進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明，重組蛋白具有免疫活性。
　　用重組蛋白制作疫苗，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，為實(shí)驗(yàn)組，用PBS緩沖液配制的疫苗免疫小鼠，為對(duì)照組。經(jīng)過4次免疫，并且每7天采集一次血清，對(duì)血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組血清抗體水平與對(duì)照組血清抗體水平差異顯著(P＜0.05)。四次免疫后，對(duì)小鼠進(jìn)行脾臟T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠