綿羊肺炎支原體山東株的分離鑒定和標(biāo)準(zhǔn)株外膜蛋白特性研究.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Myeoplasma ovipneumoniae，M．O)能夠引起綿羊和山羊的傳染性胸膜肺炎，并且同僅引起山羊傳染性膜肺炎的絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycoide subsp．capri)無交互免疫性。M．O自1982年首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)后，對(duì)我國養(yǎng)羊業(yè)造成了重大危害。本研究在M．O山東分離株鑒定的基礎(chǔ)上，調(diào)查了山東省部分羊場(chǎng)的感染情況，并闡明了M．O標(biāo)準(zhǔn)株Y-98外膜蛋白的特性和探討了快速診斷M．O的PC

2、R方法，為山東省M．O感染的防治提供了一定的技術(shù)支持。 本研究共分四個(gè)部分： 第一部分綿羊肺炎支原體山東YG株的分離與鑒定從山東某羊場(chǎng)采集因傳染性胸膜肺炎死亡的綿羊肺、胸腔滲出液等檢樣，應(yīng)用Hartleys培養(yǎng)基進(jìn)行病原體分離培養(yǎng)。將分離到的病原體采用微生物學(xué)、血清學(xué)、電鏡觀察方法及理化特性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，分離的病原體表現(xiàn)出同M.OY-98標(biāo)準(zhǔn)株完全相同的特征，故確定為綿羊肺炎支原體(命名為山東YG株)。將分離株經(jīng)氣

3、管接種進(jìn)行綿羊回歸試驗(yàn)，出現(xiàn)與臨床病例完全相同的癥狀，表明YG株M．O是造成綿羊發(fā)病和死亡的病原體。將YG株M．O接種到SPF雞胚卵黃囊中，結(jié)果表明其可以在卵黃囊中生長，并且造成雞胚的發(fā)育緩慢和死亡。用電鏡觀察，YG株M．O主要表現(xiàn)為二等分裂的繁殖方式，部分表現(xiàn)為出芽生殖。另外，觀察到M．O的細(xì)胞膜呈三層結(jié)構(gòu)，外面為絨毛狀莢膜。 第二部分IHA對(duì)山東省部分羊場(chǎng)M．O的血清學(xué)調(diào)查使用M．OY-98株制備IHA診斷抗原，對(duì)山東省濟(jì)南

4、、萊蕪、聊城和東營四地市7個(gè)羊場(chǎng)共898只不同品種、年齡的山羊和綿羊進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，以IHA效價(jià)2<'6>以上判為陽性。結(jié)果表明，各個(gè)羊場(chǎng)中均存在著的M．O感染，不同品種、年齡的羊只感染率不同。在898份被檢血清中，陽性檢出率為28.9％，其中綿羊和山羊的陽性率分別為32％和24．3％，表明綿羊陽性率明顯高于山羊；一歲以下羊只陽性率為42.8％，明顯高于其他年齡的羊只，說明此年齡羊只最易感：波爾山羊陽性率為48.3％，杜泊綿羊陽性率為

5、47.9％，明顯高于當(dāng)?shù)仄胀ㄑ蚝碗s交羊的22.5％和27.6％。 第三部分綿羊肺炎支原體外膜蛋白特性研究首先通過電鏡觀察到M．O細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和莢膜的存在，然后采用TritonX-100裂解和0.6％KI提取的方法制備綿羊肺炎支原體Y-98株外膜蛋白，經(jīng)12％SDS-PAGE分析，表明其分子量范圍在14.4-125.9KD之間。分別制備抗Y98株全細(xì)胞抗原和外膜蛋白高免血清，經(jīng)Western-blotting分析，表明外膜蛋白為綿羊

6、肺炎支原體的主要保護(hù)性抗原，而在外膜蛋白的67.6KD、39.3KD和28.8KD多肽為其主要保護(hù)性抗原。利用間接ELISA方法對(duì)外膜蛋白引起的體液免疫功能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，膜蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，免疫后第7、14和28天抗體效價(jià)分別達(dá)到了1：2<'4.25>、1：2<'7.75>和1：2<'8.75>；利用MTT法對(duì)外膜蛋白引起的細(xì)胞免疫功能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，在免疫前0天及免疫后28天對(duì)T淋巴細(xì)胞刺激的轉(zhuǎn)化率分別為8.

7、46％和18.3％。以MDCK為研究載體，待MDCK貼壁生長后接種不同濃度的外膜蛋白和M.OY-98，細(xì)胞出現(xiàn)CPE或者脫落，而抗外膜蛋白高免血清可以有效地抑制CPE和細(xì)胞脫落的發(fā)生。 第四部分快速檢測(cè)M．O的PCR方法的建立和初步應(yīng)用根據(jù)GenBank發(fā)表的支原體保守序列，使用Primer6．0設(shè)計(jì)一對(duì)支原體的通用引物，擴(kuò)增大小約為453bp的支原體保守序列。應(yīng)用該引物對(duì)綿羊肺炎支原體Y-98、分離株YG、雞滑膜支原體(MS)

8、、雞敗血支原體(MG)、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌分別用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，該引物能夠從MOY-98、分離株YG、MS和MG中特異性擴(kuò)增出453bp的片段，而不能從肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌中擴(kuò)增出該片段。將M.ODNA進(jìn)行倍比稀釋，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明該引物能夠檢測(cè)出1pg/ml濃度的DNA，具有較強(qiáng)的敏感性。分別以M.OY-98、分離株YG培養(yǎng)液、M.OYG接種致死的雞胚卵黃囊為材料，進(jìn)行PCR，