綿羊肺炎支原體培養(yǎng)特性、分子流行病學(xué)及免疫原性的研究.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起綿羊、山羊、尤其是羔羊增生性間質(zhì)性肺炎的病原體。為研究Mo的生長特性、分子流行病學(xué)以及免疫原性，本研究通過對我國綿羊肺炎支原體病制苗菌株MoGH3-3株生長曲線進行了測定，同時將其在幾種常用培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特性進行了比較；對分離于國內(nèi)的25株Mo及Mo模式株Y98株的基因組DNA采用隨機擴增多態(tài)性DNA（PAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、擴增片段長度多

2、態(tài)性方法進行基因多態(tài)性分析（AFLP）；并對分離株進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，同時對分離于8個地區(qū)的8株綿羊肺炎支原體進行免疫印跡（Western-blot）分析；對MoGH3-3株進行免疫蛋白組學(xué)研究鑒定免疫原性蛋白；對所鑒定免疫原性蛋白基因進行擴增、序列分析，再進行克隆表達和純化蛋白后，通過免疫印跡及其小鼠免疫試驗對其免疫學(xué)活性進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)：
　　1．我國綿羊肺炎支原體并滅活疫苗制苗菌

3、株MoGH3-3經(jīng)穩(wěn)定傳代后，在改良KM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)72h進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)120h時進入衰亡期。
　　2．MoGH3-3菌株在改良KM2培養(yǎng)基、TSB-1培養(yǎng)基、改良Thiaucourt氏培養(yǎng)基和10％馬血清改良KM2培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)階段的生長滴度（顏色變化單位）不同，在培養(yǎng)24、48、72、96h，MoGH3-3株在TSB-1培養(yǎng)基中的平均生長滴度高于其他三種培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的72h和96h，在TS

4、B-1培養(yǎng)基中平均最大生長滴度達到了109ccu/ml，在改良KM2培養(yǎng)基和改良Thiaucourt氏培養(yǎng)基中只有108ccu/ml，而在10%馬血清改良KM2培養(yǎng)基中僅為106ccu/ml。
　　3．26株菌的RAPD、RFLP及AFLP基因組多態(tài)性圖譜進行了聚類分析結(jié)果為：在相似系數(shù)為0.70時，26株Mo可分成6個RAPD、6個RFLP群及5個AFLP群；相似系數(shù)為0.90時，分成18個RAPD、18個RFLP群及17個AF

5、LP群，相似系數(shù)為1.00時，分成25個RAPD、26個RFLP群及26個AFLP群。提示我國Mo存在高度的基因多態(tài)性，這種多態(tài)性與地域差異相關(guān)，與宿主來源也具有一定的相關(guān)性。
　　4．分離于國內(nèi)不同地域的25株Mo菌株的SDS-PAGE蛋白模式在相似系數(shù)0.85的水平上，可將其根據(jù)不同地域來源分成8個SDS-PAGE蛋白模式群，表明我國Mo分離株蛋白模式存在地域差異。
　　5．對8個SDS-PAGE蛋白模式群中不同省區(qū)的8

6、株Mo菌的菌體蛋白進行了SDS-PAGE研究，并用Mo模式株Y98高免血清對不同地區(qū)分離的代表菌株進行了免疫印跡分析。結(jié)果不同分離株免疫印跡出現(xiàn)分子質(zhì)量分別為105kDa、83kDa、65kDa、42kDa、40kDa和26kDa共6條免疫原性蛋白帶，但83kDa和40kDa處條帶為所有菌株共有。結(jié)果表明，我國不同地區(qū)分離的代表菌株主要免疫原性蛋白存在不同程度差異，但83kDa和40kDa的2個蛋白為所有分離株共有主要免疫原性蛋白。

7、r>　　6．通過2-DE建立MoGH3-3株蛋白圖譜，利用Western-blot篩選出MoGH3-3株免疫原性蛋白，并采用MALDI-TOF-MS鑒定免疫原性蛋白。MoGH3-3株的主要免疫原性蛋白點有3個，其中2個為延伸因子Tu（ElongationfactorTu，EF-Tu），1個為丙酮酸脫氫酶E1-a亞單位（PyruvatedehydrogenaseE1-alphasubunit，PDHA）。結(jié)果表明，EF-Tu及PDHA是M

8、o主要的免疫原性蛋白。該結(jié)果將為Mo新型疫苗的研究提供理論依據(jù)。
　　7．Mopdha基因經(jīng)擴增、克隆、表達及免疫學(xué)活性分析結(jié)果為pdha基因全長1125bp，編碼375aa，G+C%為34.76%，第304-306位、379-381位、586-588位、592-594位、625-627位、811-813位、889-891位及964-966位TGA在支原體中編碼色氨酸而不是作為終止密碼子；基因序列比對及進化樹分析顯示，Mopdha

9、基因與10種支原體的pdha基因序列同源性為32.6%-85.3%，氨基酸序列同源性為39.3%-90.6%，基因序列和氨基酸序列均與豬肺炎支原體的同源性最高，分別為85.3%和90.6%；Mopdha基因在33℃、IPTG濃度為0.25mmol/L誘導(dǎo)6h的表達條件下，表達量最高；重組的PDHA蛋白可與Mo高免血清發(fā)生反應(yīng)，在免疫后血清抗體效價與對照組相比，均顯著升高（P<0.05），表明具免疫學(xué)活性。
　　本研究首次了解了Mo