肺炎支原體感染相關致病機制及分子診斷研究.pdf

1、第一部分肺炎支原體感染相關致病機制研究
　　背景：
　　肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是Eatton等首次于1944年從一位原發(fā)性非典型肺炎患者的痰標本中分離發(fā)現(xiàn)的。它是全球各年齡段呼吸道感染的常見病原體，可引起上呼吸道感染、氣管炎、支氣管炎、細支氣管炎、社區(qū)獲得性肺炎等，并可能與支氣管哮喘的發(fā)生和急性發(fā)作相關。MP感染一般呈自限性過程，預后良好，但近年來越來越多報道發(fā)現(xiàn)重癥與難治性MP肺炎呈

2、上升趨勢，部分患兒甚至出現(xiàn)嚴重致命并發(fā)癥。MP主要通過粘附宿主細胞、胞內定殖、細胞毒作用及免疫反應等方式致病，但其確切的致病機制包括肺外表現(xiàn)的發(fā)生機制仍有待進一步研究闡明。
　　我們實驗室前期研究證明MP感染A549細胞后能誘導活性氧自由基(Reactiveoxygen species，ROS)形成，而ROS又進一步誘導了DNA損傷。那么MP在不同細胞系是否具有同樣的DNA損傷效應?另外，MP的粘附作用被認為是MP致病機制中很重要

3、的因素，粘附作用與ROS的產生是否存在關聯(lián)?此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)MP感染A549細胞后引起了細胞骨架蛋白波形蛋白的上調，波形蛋白與MP致病機制又有什么關系?
　　鑒于現(xiàn)有的資料，本研究擬通過以下方面進行MP感3染相關致病機制研究：MP感染誘導不同細胞系造成DNA損傷的差異；MP誘導A549細胞產生ROS與粘附作用的關系；可能影響MP感染后A549細胞中波形蛋白表達改變的信號轉導通路；以及波形蛋白表達對MP感染A549細胞生理應激過

4、程的影響。
　　方法：
　　1.通過免疫熒光法檢測γH2AX和堿性彗星實驗檢測DNA損傷。
　　2.流式細胞術檢測ROS水平。
　　3.免疫熒光觀察波形蛋白量的變化。
　　4.蛋白質印跡法檢測MAPK通路相關分子表達量的改變，熒光探針法檢測胞內Ca2+水平。
　　5.siRNA干擾波形蛋白表達后研究對MP感染A549細胞的生理功能的影響。
　　結果：
　　1.A549細胞經MP處理(10

5、CFU/cell)4h后經免疫熒光檢測γH2AX焦點無增加，而MP處理12h與24h后γH2AX焦點形成顯著增加。HEK293細胞經MP處理4h后有一個非常快速的增加，而隨之的12h與24h后γH2AX焦點并無增加。彗星實驗提示A549細胞經MP處理6h和12h后均存在明顯的拖尾現(xiàn)象。
　　2.去粘附能力的MP與未處理的MP均能誘導A549細胞產生ROS，但兩者誘導ROS產生的能力比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.免疫熒光觀察

6、到MP感染A549細胞后波形蛋白的熒光強度增強。
　　4.MP感染A549細胞后胞內ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、Ca2+水平均無變化。
　　5.siRNA干擾波形蛋白后細胞的形態(tài)和生存率不受影響，但MP感染后誘導的γH2AX焦點形成減少。
　　結論：
　　1.MP可在A549細胞和HEK293細胞誘導產生DNA損傷，但產生的程度和時間不同，提示不同細胞系對MP感染所誘導的DNA損傷的效應存

7、在差異。
　　2.MP誘導 A549細胞產生ROS與是否粘附無關。
　　3.MP感染A549細胞后誘導波形蛋白上調，MAPK(ERK1/2及p38)及Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號轉導通路不參與MP誘導波形蛋白上調的過程。
　　4.波形蛋白可能影響了MP誘導A549細胞產生DNA損傷的過程。
　　第二部分不同呼吸道標本中肺炎支原體分子診斷的研究
　　背景：
　　MP常引起非特異性的呼吸道癥狀，且對β

8、-內酰胺類抗生素治療無效，所以正確及時的診斷就極為重要。MP的實驗室診斷目前標準不一，尚缺乏敏感且特異的診斷方法。MP感染的診斷方法主要有培養(yǎng)、血清學方法以及PCR方法。其中血清學方法和PCR方法是臨床上檢測MP感染的主流手段。鼻咽吸出物(nasopharyngeal aspirate，NPA)和肺泡灌洗液(bronchaoalveolar lavage，BAL)均能作為PCR方法的標本。有關比較使用BAL和NPA作為PCR標本的靈敏度

9、和特異度的文獻很少。故本研究中我們擬評價不同的呼吸道標本(NPA和BAL)在熒光實時定量PCR診斷兒童MP感染中的價值，并求尋找到有助于診斷MP肺炎(MPP)的臨床特征。
　　方法：
　　1.收集406例住院的肺炎患兒的NPA和BAL標本進行熒光實時定量PCR檢測MP的DNA，并采集外周血檢測MP特異性IgM。
　　2.復習和整理所有患兒的病例記錄，收集其中相關實驗室數(shù)據(jù)，包括血常規(guī)、CRP、免疫球蛋白、T細胞亞群等。

10、
　　結果：
　　1.共101例患兒診斷為MPP(24.9％)。MPP患兒年齡中位數(shù)為4.1歲，非MPP患兒年齡中位數(shù)為2.4歲，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.001)。
　　2.MPP與非MPP相比，相關實驗室數(shù)據(jù)包括白細胞計數(shù)、中性粒細胞數(shù)目、免疫球蛋白(除了血清IgM)、T細胞亞群、BAL，細胞學計數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義。
　　3.BAL-PCR陽性患兒BAL巨噬細胞比例低于BAL-PCR陰性患兒(p=0.003

11、)，而BAL中性粒細胞比例較高(p=0.007)。
　　4.采用NPA與BAL作為PCR的標本的各項診斷指標相比差異均無統(tǒng)計學意義：NPA的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為78.6％，63.4％，39.8％和90.6％。BAL的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為70.3％，58.7％，36.0％和85.6％。
　　結論：
　　1.年齡是有助于診斷MPP的臨床特征。
　　2.BAL的PCR檢測