肺炎支原體P1C蛋白免疫學(xué)活性及plc DNA融合疫苗的初步研究.pdf

1、肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae, Mp）感染不僅可引起支原體肺炎、氣管炎、支氣管炎、哮喘等呼吸道疾病，還可導(dǎo)致腦膜腦炎、心肌炎、腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等肺外感染和并發(fā)癥。Mp感染多見(jiàn)于學(xué)齡兒童及青少年，是兒童社區(qū)獲得性肺炎最主要的病原體，其發(fā)病率逐年上升，占10％～30％，流行期間為30％～50％，且可引起地區(qū)性和世界性流行。雖然大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等抗生素可控制Mp感染，但耐藥菌株的不斷增多給臨床治療帶來(lái)了困難。因此

2、，利用Mp免疫優(yōu)勢(shì)抗原基因研制疫苗，是預(yù)防和控制Mp感染的關(guān)鍵。
　　P1粘附素是Mp最主要的粘附蛋白和免疫優(yōu)勢(shì)抗原，其中和抗體能阻止80％以上的Mp粘附到宿主細(xì)胞。由此，P1蛋白是最具潛力的Mp候選疫苗。但由于p1基因中含有RepMP4和RepMP2/3兩個(gè)高度變異的重復(fù)序列，且基因中含有21個(gè)“UGA”密碼子，克隆和表達(dá)p1全基因非常困難。本文分析了p1基因的變異情況，選取了P1蛋白第1125～1395位氨基酸免疫優(yōu)勢(shì)表位區(qū)（

3、P1C蛋白），研究其生物學(xué)活性和其所構(gòu)建的核酸疫苗的免疫活性及白細(xì)胞介素2(interleukin2，IL-2)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（B subunit ofEscherichia coli heat-labile enterotoxin，LTB）對(duì)p1c核酸疫苗的免疫佐劑效應(yīng)。
　　目的:
　　檢測(cè)兒童呼吸道感染患者中分離的159例Mp臨床分離株的基因型，分析p1基因的變異情況，確定p1基因的保守序列。構(gòu)建含Mp

4、 P1基因第3373～4185位核苷酸(p1c)的原核表達(dá)載體pGEX6p-2/p1c，純化表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/c，制備多克隆抗體(pAb);檢測(cè)其pAb的滴度及對(duì)Mp粘附HeLa細(xì)胞的抑制作用。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/p1c(pP1C)、pcDNA3.1(+)/p1c-IL-2(pP1C-IL-2)和pcDNA3.1(+)/LTB-p1c(pLTB-P1C)，通過(guò)肌肉注射和鼻內(nèi)接種方式免疫小鼠，檢測(cè)疫苗所誘發(fā)的特異性

5、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平;用Mp經(jīng)呼吸道感染疫苗免疫后的小鼠，觀察肺組織病理變化和支氣管灌洗液中Mp菌落計(jì)數(shù)，分析疫苗接種小鼠對(duì)Mp感染的免疫保護(hù)作用，為研制Mp核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.復(fù)蘇Mp臨床株，分離培養(yǎng)單個(gè)菌落并進(jìn)行PCR鑒定。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析對(duì)159例Mp臨床株進(jìn)行p1基因分型，并檢測(cè)p1變異。
　　2.設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增p1基因第3373～4185位

6、核苷酸(p1c基因)，構(gòu)建pGEX6p-2/p1c原核細(xì)胞表達(dá)重組體，用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變將p1c基因中的“TGA”突變成“TGG”。重組體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中表達(dá)融合蛋白P1C-GST，用高親和力GST Resin親和柱純化P1C-GST蛋白，研究P1C-GST蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附活性;將純化的P1C-GST蛋白免疫BALB/c鼠，制備多克隆抗體(pAb)，研究P1C-GST pAb對(duì)Mp的粘附抑制作用。EL

7、ISA分析P1C-GST蛋白的免疫原性和抗原性。
　　3.將p1c基因亞克隆至真核表達(dá)載體構(gòu)建pP1C重組體，并將p1c基因與細(xì)胞因子佐劑IL-2基因和黏膜佐劑LTB基因分別通過(guò)一段特殊核苷酸序列(GAT CCG AGA GTA CCG AGC)連接，構(gòu)建pP1C-IL-2和pLTB-P1C雙基因融合表達(dá)重組體。將pP1C和pP1C-IL-2經(jīng)肌肉注射和鼻內(nèi)接種方式免疫小鼠，pLTB-P1C鼻內(nèi)途徑免疫小鼠。用ELISA法檢測(cè)血清

8、和支氣管灌洗液中特異性抗體(IgG、IgA)的水平、IgG抗體亞類(lèi)和IFN-γ、 IL-4水平，用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)，以分析疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
　　4.p1c單基因或融合基因疫苗分別免疫小鼠后，將Mp經(jīng)呼吸道感染小鼠，檢測(cè)Mp呼吸道攻擊后小鼠肺組織病理學(xué)改變及支氣管灌洗液中Mp的菌落形成單位，以分析疫苗的免疫保護(hù)效果。
　　結(jié)果:
　　1.159例Mp臨床標(biāo)本中，142例為Mp

9、Ⅰ型(89.31％)，17例為MpⅡ型(10.69％); PCR-RFLP法共檢測(cè)出21例臨床突變株，其中10株為Mp V2c突變株;3株為V2a突變株;7株為V1a突變。研究發(fā)現(xiàn)了一株新型V2型突變株Mp100（命名為V2d突變株），其p1基因RepMP4區(qū)最接近309(V2a)，RepMP2/3區(qū)域中有142bp(2772～2913)序列完全同源重組了一段p1基因以外的RepMP2/3-J序列(606517～606658)。

10、　　2.PCR擴(kuò)增出約813bp的目的片段;構(gòu)建了P1C蛋白原核表達(dá)重組體pGEX6p-2/p1c，通過(guò)PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變成功地將P1C基因中的TGA突變?yōu)門(mén)GG。原核表達(dá)重組體在E.coli中表達(dá)出一相對(duì)分子量(Mr)約為66kD的目的蛋白，該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性形式存在。經(jīng)高親和力GST Resin純化柱純化，得純度達(dá)95％以上的重組蛋白。
　　3.用純化的P1C-GST免疫BALB/c小鼠，制備了pAb，抗體效

11、價(jià)均在1∶4000以上，且能與Mp感染患者血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
　　4.粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P1C對(duì)HeLa細(xì)胞有粘附活性，粘附抑制試驗(yàn)顯示P1C的pAb可抑制Mp對(duì)HeLa細(xì)胞的粘附，抑制強(qiáng)度與抗體水平呈正相關(guān)，抗體滴度越高，抑制作用越強(qiáng)。
　　5.p1c單基因疫苗免疫組、p1c-IL-2雙基因融合疫苗免疫組小鼠經(jīng)肌注和鼻飼免疫后，隨著接種次數(shù)的增多血清抗體水平逐漸升高。第一次免疫后第2w，小鼠血清中可檢測(cè)到特異性抗體，第6w

12、特異性抗體水平顯著升高，第8w抗體水平基本穩(wěn)定，雙基因融合疫苗免疫組血清抗體水平較單基因免疫組高，兩種均與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.01）。檢測(cè)抗體亞類(lèi)發(fā)現(xiàn)單基因免疫組IgG1及IgG2a抗體均較高，而雙基因融合疫苗免疫組IgG2a升高更為顯著。融合疫苗經(jīng)鼻飼免疫所誘生的呼吸道局部粘膜抗體顯著高于單基因免疫組（P＜0.05），肌注免疫組小鼠未產(chǎn)生明顯的黏膜抗體。p1c單基因疫苗免疫組、p1c-IL-2雙基因融合疫苗免疫組支氣管灌洗液中

13、IFN-γ和IL-4水平較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），且雙基因疫苗組較單基因疫苗組分泌的IFN-γ和IL-4增高更顯著（P＜0.05）。疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均較對(duì)照組強(qiáng)。肌注組小鼠所誘生的血清IgG抗體滴度和淋巴細(xì)胞增殖均強(qiáng)于鼻飼組（P＜0.05）。
　　6.用Mp攻擊各免疫組小鼠，p1c-IL-2雙基因融合疫苗免疫組小鼠和p1c單基因疫苗組小鼠的肺間質(zhì)炎癥明顯減輕，病變區(qū)域較局限，肺泡間隔輕度增寬，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)

14、胞浸潤(rùn)減少。兩組的肺組織炎癥病理評(píng)分明顯低于對(duì)照組;p1c單基因組和p1c-IL-2雙基因疫苗免疫組小鼠支氣管灌洗液中Mp的菌落數(shù)較對(duì)照組明顯減少，p1c-IL-2雙基因疫苗免疫組小鼠的Mp菌落數(shù)最少。但兩組肺組織病理評(píng)分和菌落計(jì)數(shù)差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　7.LTB-p1c雙基因融合疫苗組小鼠肺組織炎癥減輕，肺組織病理評(píng)分和Mp菌落數(shù)均低于對(duì)照組，但Mp菌落數(shù)較p1c單基因疫苗減少，但差異無(wú)顯著性。LTB-p1c組小鼠

15、支氣管灌洗液中的血清總抗體、sIgA和支氣管灌洗液和血清中IFN-γ、IL-4水平明顯高于p1c核酸疫苗組(P＜0.05);
　　8.鼻飼接種LTB-p1c免疫組小鼠與p1c-IL-2疫苗組相比，支氣管灌洗液中的IFN-γ和IgA顯著增高，但兩組小鼠肺組織炎癥和Mp菌落計(jì)數(shù)差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.159株Mp臨床株主要為Ⅰ型。21株p1基因發(fā)生突變，Ⅱ型突變率高于Ⅰ型。發(fā)現(xiàn)一株新的p1基因突

16、變株(V2d)。
　　2.P1C融合蛋白有粘附活性，并具有較好的免疫原性和抗原性。
　　3.p1c、LTB-p1c和p1c-IL-2核酸疫苗均能刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用。
　　4.LTB-p1c和p1c-IL-2核酸疫苗較p1c單基因疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答水平和免疫保護(hù)作用。
　　4.p1c核酸疫苗鼻飼免疫組小鼠支氣管灌洗液產(chǎn)生高水平的IgA，但血清IgG水平低于肌注組，在感染早