兔產(chǎn)氣莢膜梭菌（A型）α毒素原核表達(dá)產(chǎn)物免疫原性分析.pdf

1、兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病(Clostridium perfringens disease)是由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的兔的一種消化道傳染病,各年齡、各品種兔均可發(fā)病,以幼兔和青年兔發(fā)病率最高,死亡率可達(dá)100﹪,嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展.對(duì)于該病主要致病因子α毒素的研究具有重要意義.該實(shí)驗(yàn)從A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NJ株)的總DNA中,通過(guò)PCR擴(kuò)增出α毒素全基因,構(gòu)建克隆載體pMD18TC α.測(cè)序結(jié)果顯

2、示A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NJ株)的α毒素基因全長(zhǎng)1194bp,含有完整的開(kāi)放閱讀框,編碼398個(gè)氨基酸,其中前28aa為信號(hào)肽,后370aa構(gòu)成成熟的α毒素.將核苷酸序列與GeneBank中已發(fā)表的菌株NCIB19681(typeB)、NCIB10662(typeC)和L9(typeD)的α毒素基因序列進(jìn)行比對(duì),同源性達(dá)到99.27﹪.將α毒素全基因從克隆載體pMD18TC α亞克隆到表達(dá)載體pPRO-EX HTb中,構(gòu)建表達(dá)載體pPROH

3、TbCα,并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)研究.將α毒素基因部分序列從克隆載體pMD18TCα分別亞克隆到表達(dá)載體pPRO-EX HTa和pET-30b中,獲得重組表達(dá)載體pPROHTaPα和pET30bPα,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出特異的大小分別為36KD和38KD的融合蛋白.光密度掃描分析重組菌BL21(DE3)pET30bPα表達(dá)的蛋白含量達(dá)到30﹪,經(jīng)金屬親和層析獲得高純度的His-tagged融

4、合蛋白.采用Western-blot分析表明,重組菌BL21(DE3)pPROHTaPα和BL21(DE3)pET30bPα表達(dá)出的特異性產(chǎn)物和純化產(chǎn)物均具有和α毒素抗血清反應(yīng)的抗原特異性.把以包涵體形式存在的表達(dá)的重組蛋白α toxinA和α toxinB,以尿素變性,經(jīng)復(fù)性、濃縮后獲得了可溶性的蛋白質(zhì),并對(duì)可溶性蛋白α toxinB凝膠過(guò)濾層析的純化方法進(jìn)行了摸索.免疫瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白α toxinA和α tox