羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與α毒素的原核表達(dá)和免疫原性研究.pdf

1、目的:產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)是一種廣泛分布于水源、土壤等自然界以及動(dòng)物腸道中的重要病原體,常導(dǎo)致人和家畜多種重要疾病,如:人氣性壞疽、食物中毒,牛羊猝死癥、羊腸毒血癥、羔羊腹瀉、禽壞死性腸炎等。由該菌引起的感染發(fā)病急、病程短、死亡率高,常給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,了解和掌握新疆羊源性產(chǎn)氣莢膜梭菌主要流行毒素型和菌株耐藥狀況,開(kāi)展毒力基因的原核表達(dá)和免疫原性研

2、究將為該菌感染的防治提供參考資料。
　　方法:本文對(duì)2010-2012年新疆部分羊場(chǎng)送檢病料進(jìn)行涂片鏡檢、培養(yǎng)特性觀察、生化試驗(yàn)初步分離鑒定出產(chǎn)氣莢膜梭菌。用PCR擴(kuò)增16S rRNA序列,并進(jìn)行序列測(cè)定和同源性比對(duì),對(duì)確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進(jìn)行毒素分型,分析新疆地區(qū)主要流行毒素型。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的厭氧菌抗微生物藥物敏感試驗(yàn)方法(厭氧菌的抗微生物藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),2005)選取青霉素,鹽酸克林霉素,甲硝唑,頭孢曲松,替卡西林等藥物

3、對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè),了解菌株耐藥狀況。
　　參考GenBank(登錄號(hào)X17300.1)已發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的全基因序列,設(shè)計(jì)針對(duì)α毒素成熟肽序列的引物,采用PCR方法擴(kuò)增α毒素成熟肽序列,將其插入質(zhì)粒pET-28b構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28b-cpa。重組載體pET-28b-cpa經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plys S感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用S

4、DS-PAGE和Western blot檢測(cè),確定其表達(dá)形式和反應(yīng)原性,并對(duì)重組菌的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化確定最佳誘導(dǎo)條件。采用Ni-NTA對(duì)α毒素進(jìn)行批量純化,使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化蛋白濃度,將純化蛋白與弗氏佐劑等體積混合制備亞單位疫苗免疫小鼠,通過(guò)抗體檢測(cè)和攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫效果。
　　結(jié)果:通過(guò)病料染色鏡檢、細(xì)菌分離、培養(yǎng)特性觀察、生化鑒定和16S rRNA檢測(cè)結(jié)果表明,從臨床送檢病料中共分離49株產(chǎn)氣莢膜

5、梭菌。毒素分型結(jié)果顯示,毒素A型菌株占61.2％(30/49),毒素B型菌株占2.04%(1/49),毒素D型菌株占36.7%(18/49),表明當(dāng)前新疆地區(qū)羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要流行株為毒素A型和D型。
　　對(duì)實(shí)驗(yàn)分離得到的菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,對(duì)甲硝唑、克林霉素、青霉素、頭孢曲松、替卡西林耐藥菌株分別為79.6%、49.0%、38.8%、12.2%和10.2%。從結(jié)果可以看出,我國(guó)羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥情況比較嚴(yán)重。

6、　　本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出了α毒素成熟肽序列,其分子量大小為1110bp;構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28b-cpa并轉(zhuǎn)化受體菌,通過(guò)目的基因誘導(dǎo)表達(dá),檢測(cè)結(jié)果表明,重組α毒素蛋白分子量為42.1kDa,與預(yù)期大小相符,且具有反應(yīng)原性;對(duì)表達(dá)條件進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn),目的基因在25℃,IPTG濃度1.0mmol/L,誘導(dǎo)4h的條件下獲得最佳表達(dá),目的蛋白占菌體可溶蛋白的34.6%,且以可溶性表達(dá)為主。用重組蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠,結(jié)果表明,重組α毒