鹿源BVDV分離鑒定、E-,0-基因的克隆與表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、本文分離鑒定了梅花鹿源牛病毒性腹瀉病毒BVDV(CCSYD株)；對(duì)4株(CCSYD株和另外3株梅花鹿源BVDV分離株(CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株))BVDVNS2-3基因和CCSYD分離株E0基因進(jìn)行了克隆與序列分析；對(duì)CCSYD分離株E0基因進(jìn)行了原核表達(dá)和真核表達(dá)；檢測(cè)了CCSYD分離株基因苗的免疫原性；篩選了CCSYD分離株BVDV敏感藥物。結(jié)果如下： 1對(duì)從吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)區(qū)梅花鹿流產(chǎn)胎兒肝臟病料中分離出的

2、病毒，進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。結(jié)果表明：該毒株接種于MDBK傳代細(xì)胞后出現(xiàn)了BVDV典型而規(guī)律的細(xì)胞病變，其理化特性與BVDV相同，致細(xì)胞病變作用可被BVDV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株C24V株的牛陽(yáng)性血清所阻斷，電鏡負(fù)染觀察病料接種MDBK細(xì)胞的F1代濃縮病毒液，可見(jiàn)典型的BVDV粒子形態(tài)，從F1代濃縮病毒液中分別擴(kuò)增出402bp(NS2-3)和706bp(E0)的目的片段。證明該毒株是BVDV，命名為CCSYD株。 2對(duì)從吉林不同地區(qū)分離的4株(

3、CCSYD株，CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株)BVDV的NS2-3基因外源序列插入?yún)^(qū)進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，將該擴(kuò)增片段與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化JM-109工程菌，構(gòu)建成重組克隆質(zhì)粒pMD18-T/NS2-3，并測(cè)定其序列，將測(cè)定的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：CCSYD分離株NS2-3擴(kuò)增區(qū)核苷酸序列與BVDV其他株相比的同源性，依次為VEDEVAC株100％，184株99.3％，H株96.6％，ZM

4、95株98％，OSLOSS株94.9％，Draper株92.6％，ILLC株92.4％，SNC株91.1％，YAK株82.3％，D株83.0％，3142株84.8％，3887株84.3％，C24V株83.2％，NADL株83.4％，SD1株83％，Singer株82.8％，06-APR-1993株77.0％，NY-1株75.8％，CCKCD株42.3％，CCJYD株42.3％，JLCYD株42.5％。CCSYD株NS2-3擴(kuò)增區(qū)氨基酸序

5、列與BVDV其他株相比的同源性，依次為VEDEVAC株100.0％，184株99.4％，H株94.5％，ZM95株95.7％，OSLOSS株93.3％，Draper株93.9％，ILLC株93.3％，SNC株92.0％，YAK株88.3％，D株90.2％，3142株92.0％，3887株89.0％，C24V株86.5％，NADL株88.3％，SD1株90.8％，Singer株87.1％，06-APR-1993株82.8％，NY-1株72

6、.4％，CCKCD株28.2％，CCJYD株28.2％，JLCYD株28.2％。本次分離的CCSYD株BVDV在這一區(qū)域中既沒(méi)有外源序列的插入，也沒(méi)有基因重組、基因重排或基因缺失，但存在某些核苷酸的替換；而另外3個(gè)分離株則有外源序列的插入和基因重排；表明病毒的致細(xì)胞病變作用除與外源序列的插入、基因重組、基因重排或基因缺失有關(guān)外，還與核苷酸的替換有關(guān)。CCSYD株屬基因Ib亞型，CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株屬待定基因型。

7、 3對(duì)從梅花鹿的流產(chǎn)胎兒肝臟中分離出CCSYD株BVDV的E0基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，將該擴(kuò)增的片段與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化JM-109工程菌，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18-T/E0，并測(cè)定其序列，將其與已報(bào)道的瘟病毒代表株相應(yīng)序列做了比較，預(yù)測(cè)了E0蛋白的抗原表位、親水性和等電點(diǎn)等。結(jié)果表明：CCSYD分離株E0基因大小為681bp，與報(bào)道9株BVDV(VEDEVAC、Bega、C24V、ILLC、NADL、OSLOSS、R19

8、35、SD-1、Y546)和7株豬瘟病毒(ALD、Brescia、c、GPE、兒、LN9912、SM)及3株羊邊界病毒(BD31、C413、BDVX818)相比，核苷酸序列的同源性依次為98.6％-84.8％、76.1％-74.7％、77.0％-76.7％;氨基酸的同源性分別為98.7％-91.6％、79.9％-78.3％、83.9％-80.6％；CCSYD株E0蛋白等電點(diǎn)7.61，在pH值7.0時(shí)，帶的電荷為1.99；CCSYD分離株

9、E0蛋白的抗原性指數(shù)、親水性峰值都較高的區(qū)域有8-16、23-29、59-67、70-81、96-109、114-122，127-134、137-143、165-172、186-198、213-221；以E0基因?yàn)榕卸ㄒ罁?jù)，CCSYD分離株也為基因Ib亞型，E0基因的核苷酸序列可做為BVDV基因分型的依據(jù)。 4將測(cè)序正確的pMD18-T/E0克隆質(zhì)粒雙酶切(BmH1和Xho1)得E0基因，然后將E0基因亞克隆到pET28a載體相

10、同酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a/E0，將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)并進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，對(duì)鑒定的陽(yáng)性菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a/E0，重組菌在IPTG誘導(dǎo)下能表達(dá)目的蛋白，其含量占菌體總蛋白的9.25％。 5將測(cè)序正確的pMD18-T/E0克隆質(zhì)粒雙酶切(BmH1和Xho1)得E0基因，然后將E0基因亞克隆到PVAX1載體相同酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PV

11、AX1/E0，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。結(jié)果表明：RT-PCR法檢測(cè)到E0目的基因在BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄；用間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒PAX1/E0在體外真核細(xì)胞中已表達(dá)E0目的蛋白。 6用梅花鹿源BVDV基因苗(PVAX1/E0)不同免疫劑量和免疫次數(shù)免疫家兔，間接ELISA檢測(cè)其血清抗體應(yīng)答水平，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并將其免疫應(yīng)答水平與BVDV梅花鹿源分離株和

12、C24V標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：梅花鹿源BVDV基因苗免疫家兔既可產(chǎn)生體液免疫又可產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答?；蛎绺邉┝拷M比低劑量組體液免疫應(yīng)答水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平高，基因苗免疫次數(shù)對(duì)體液免疫應(yīng)答水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答均無(wú)影響。 7采用組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，測(cè)試了利巴韋林、黃芪、魚(yú)腥草、干擾素a2b、莪術(shù)油、雙黃連粉針劑共6種抗病毒藥物在MDBK細(xì)胞體外培養(yǎng)中的最大安全濃度。進(jìn)一步測(cè)定了這6種藥物成分對(duì)梅花鹿源BVDV感染MDBK細(xì)胞的影