PRRSV河南株ORF7基因的克隆表達及N蛋白免疫原性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)。PRRSV現(xiàn)分為歐洲型和美洲型兩個基因型,兩型毒株之間基因差異大,美洲型毒株之間的基因差異更大。PRRSV基因型的存在和基因的多變性,給臨床診斷和疫苗研發(fā)應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。核衣殼蛋白N蛋白由ORF7編碼,美洲型與歐洲型毒株N蛋白各含123和128個氨基酸,N蛋白在全病毒中含量最高,免疫原性最強,是病毒感染后最早誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性非中和抗體的蛋白。因此,

2、PRRSVN蛋白在病毒的早期診斷和致病免疫機理研究中具有重要意義。
　　 為了快速診斷和檢測PRRSV,研究了應(yīng)用RT-PCR和基因測序技術(shù)快速檢測PRRSV是否美洲型和高致病性變異株的分子診斷方法。根據(jù)參考株IAF-exp91和LV ORF7基因序列設(shè)計出2對引物,引物S1R1是一對特異性引物,它只能擴增美洲型PRRSV基因序列,不能擴增歐洲型PRRSV基因序列;引物S2R2可以擴增美洲型和歐洲型的PRRSV序列。用兩對引物擴

3、增兩河南分離株P(guān)RRSVHN07-1和HN07-2,發(fā)現(xiàn)兩引物均克隆出了相對應(yīng)的堿基序列,并且ORF7基因的長度均為372bp,編碼123個氨基酸,測定的序列完全相同。進而用DNAStar軟件對兩河南分離株的ORF7序列與在GenBank上選取的24株P(guān)RRSV ORF7序列進行比較分析。結(jié)果顯示,本試驗克隆的ORF7序列與三株歐洲型PRRSVORF7序列的同源性在65.1％-66.9％之間,與美洲型PRRSV ORF7序列同源性在92

4、.2％-99.7％之間,且與中國分離株EF112446(HUB2)、EF112447(HEB1)、EF075945(HUB1)的同源性高達99.5％,與中國分離株EF112445(JXA1)同源性高達99.7％。根據(jù)高致病性PRRSV Nsp2基因的缺失信息設(shè)計并合成了3條引物,經(jīng)過RT-PCR,引物P1P3可以擴增出438bp的堿基序列,引物P2P3可以擴增出217bp的堿基序列。對病毒核酸的檢測與分析結(jié)果表明,PRRSV河南分離株H

5、N07-1和HN07-2均屬于美洲型毒株且都是高致病性PRRSV變異株。
　　 為了給PRRSV地方分離株N蛋白的研究與應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ),本研究首先成功克隆到PRRSV河南分離株HN07-1和HN07-2的N蛋白基因并登錄于GenBank(登錄號HQ025967)。本研究成功構(gòu)建了PRRSV河南分離株N蛋白的原核重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-1-N及其表達菌,成功進行了重組N蛋白的可溶性表達,并獲得其優(yōu)化表達的條件參數(shù)和表達蛋白的