雞減蛋綜合征病毒河北分離株六鄰體蛋白基因的克隆表達及免疫原性研究.pdf

1、本研究主要對減蛋綜合征病毒河北分離株(EDSV-HB)的六鄰體(Hexon)基因進行了擴增、克隆、測序、表達及免疫原性的研究。 參照GeneBank上發(fā)表的國際標準株AV-127六鄰體(Hexon)基因序列，利用Premer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物。將病毒經(jīng)鴨胚增殖及PEG沉淀法純化后，用SDS-蛋白酶K的方法提取出病毒DNA，利用PCR技術(shù)擴增六鄰體蛋白基因，與DBS-T載體連接后轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR

2、及酶切鑒定篩選出陽性重組子。經(jīng)測序及序列分析表明，所擴增克隆的基因片段包括了EDSV-HB株Hexon基因從起始密碼子ATG到終止密碼子TGA在內(nèi)的完整序列。 將EDSV-HB株Hexon基因序列與EDSV國內(nèi)外其它參考毒株進行序列比較，分析EDSV-HB株的遺傳變異情況，得到如下結(jié)果和結(jié)論：EDSV-HB株的六鄰體蛋白基因全長2733bp，共編碼910個氨基酸，與GelaeBallk上公布的EDSV國際標準株AV-127的長度

3、一致。由系統(tǒng)發(fā)育樹、EDSV-HB株核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列可知，EDSV-HB、國際標準株AV-127與中國株AAV-2同屬一個分枝，且EDSV各毒株之間六鄰體蛋白同源性也極高，均為98.6％以上，但國際標準株AV-127是強毒株，_中國株AAV-2則屬弱毒株。本研究中，相比較而言EDSV-HB株六鄰體蛋白的氨基酸序列與國際標準株AV-127六鄰體蛋白的氨基酸序列同源性更高，達99.7％，而與AAV-2同源性為98.6％。中國株

4、AAV-2與國際標準株AV-127六鄰體蛋白的氨基酸序列的同源性為98.9％，因此可以得出EDSV-HB株與國際標準株AV-127同為強毒株的結(jié)論。EDSV-HB株六鄰體基因核苷酸及氨基酸序列與其它哺乳動物及人腺病毒同源性很低，核苷酸同源性為48.4％-78.4％，氨基酸同源性為57.9％-80.9％。另外，與禽腺病毒I群病毒代表株Fowl Adenovirus(CELO)的核苷酸同源性為51.8％，氨基酸同源性為78.3％；而與禽腺病

5、毒II群病毒代表株HEV(雞出血性腸炎病毒)的核苷酸同源性也僅為40.5％，氨基酸同源性為69.1％。因此，要將減蛋綜合征病毒歸入禽腺病毒III群。 作者將克隆得到的EDSV-HB株Hexon基因亞克隆到pET-32a-c(+)原核表達載體對其進行了表達，經(jīng)SDS-PAGE、Western-blotting檢測，結(jié)果表明Hexon基因在大腸桿菌BL21(DE3)中與6×His一同表達為約11OKDa的融合蛋白，且表達產(chǎn)物具有免疫