豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5-M蛋白可溶性表達(dá)、純化及免疫原性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征也被稱為豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起豬的病毒性傳染病。感染該病毒的豬只，會出現(xiàn)食欲廢絕、體溫升高、孕后期出現(xiàn)莫名的流產(chǎn)、出生仔豬為死胎和木乃伊胎;日齡較小仔豬則表現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)癥狀，并且會使感染PRRS的動(dòng)物繼發(fā)感染其他疾病尤其是細(xì)菌性疾病。1987年，藍(lán)耳病首次被報(bào)道于美國，現(xiàn)在更是給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害。近些年來，我國爆發(fā)和流行新型的高致病性藍(lán)耳病，更是給養(yǎng)豬行業(yè)造成了嚴(yán)峻的打擊。GP5蛋白

2、、M蛋白是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)蛋白。本試驗(yàn)將密碼子線性優(yōu)化后的GP5蛋白與M蛋白進(jìn)行串聯(lián)，命名為GP5/M蛋白，構(gòu)建了十個(gè)帶有不同可溶性標(biāo)簽的GP5/M重組原核表達(dá)載體，分別將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以表達(dá)的高可溶性GP5/M重組蛋白作為抗原，免疫家兔，探究其免疫原性。
　　將高致病性PRRSV HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的編碼核酸序列進(jìn)行密碼子偏愛性優(yōu)化設(shè)計(jì)，然后

3、進(jìn)行串聯(lián)，命名為GP5/M蛋白。十種不同標(biāo)簽質(zhì)粒pEX-His6-Grifin-TEV-LIC、pEX-His6-GST-TEV-LIC、pEX-His6-MBP-TEV-LIC、pEX-His6-NusA-TEV-LIC、pEX-His6-Sumo-TEV-LIC、pEX-His6-Thioredoxin-TEV-LIC、pEX-His6-γ-crystallin-TEV-LIC、pEX-His6-ArsC-TEV-LIC、pEX-H

4、is6-PpiB-TEV-LIC、pEX-His6-CeHSP17-TEV-LIC分別用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，獲得Grifin(549bp)、GST(786bp)、MBP(1236bp)、NusA(1617bp)、Sumo(432bp)、Thioredoxin(459bp)、γ-crystallin(666bp)、ArsC(555bp)、PpiB(624bp)、CeHSP17(513bp)十種融合標(biāo)簽的核苷酸序列，將十種不同可溶性

5、標(biāo)簽的線性片段與表達(dá)載體pET-21b進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)鑒定正確后，把pET21b-Grifin、pET21b-GST、pET21b-MBP、pET21b-NusA、pET21b-Sumo、pET21b-Thioredoxin、pET21b-γ-crystallin、pET21b-ArsC、pET21b-PpiB、pET21b-CeHSP17分別和GP5/M目的基因連接，構(gòu)建十種重組表達(dá)載體。分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)I

6、PTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳對融合蛋白的表達(dá)量和可溶性進(jìn)行綜合分析，篩選出使GP5/M重組蛋白可溶性表達(dá)水平增加的融合標(biāo)簽，并進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示:十種帶有可溶性標(biāo)簽的載體，蛋白表達(dá)水平均有所提高;從蛋白可溶性水平看，除Grifin-GP5/M融合蛋白以不可溶的包涵體形式存在外，其他標(biāo)簽的融合蛋白可溶性表達(dá)水平均得到提高，其中MBP-GP5/M蛋白的可溶性表達(dá)水平超過了95％，所以十個(gè)標(biāo)簽中，MBP與GP5/M蛋白相融合的可

7、溶性表達(dá)效果最好。
　　十種帶有不同可溶性標(biāo)簽的GP5/M重組蛋白通過Ni-NTA Agarose親和純化，并獲得了高純度的MBP-GP5/M重組蛋白質(zhì)。
　　將大批量純化得到的MBP-GP5/M重組蛋白與等體積的佐劑乳化，制備基因工程亞單位疫苗，通過免疫家兔，檢測重組蛋白的免疫原性以及刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的水平。
　　綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了十個(gè)不同融合標(biāo)簽的GPS/M表達(dá)載體;建立了穩(wěn)定獲得GPS/M重組蛋白質(zhì)的