納米金載體增強(qiáng)PRRSV GP5蛋白免疫原性的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒（porcine respiratory and。reproductive syndrome virus，PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。該病自1987年在美國首次報道以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。免疫接種是預(yù)防與控制PRRS的主要措施，但弱毒疫苗存在散毒，滅活疫苗免疫效果不理想，而基因工程疫苗又普遍存在免疫

2、原性低的缺點。納米顆粒由于能夠提高抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫的水平，作為免疫佐劑可提高疫苗對動物的免疫效果而成為免疫佐劑的研究的熱點。 本研究選擇能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和杭體的PRRSV免疫保護(hù)蛋白GP5，根據(jù)GenBank中公布的PRRSV基因序列（EU709837），設(shè)計一對PCR引物，以浙江分離株為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增出ORF5基因全序列。依據(jù)GP5蛋白的結(jié)構(gòu)特點，以PCR技術(shù)構(gòu)建了缺失信號肽及三處跨膜區(qū)的重組ORF

3、5基因，命名為g-ORF5。將g-ORF5基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中，轉(zhuǎn)化入E．coli BL21。經(jīng)酶切和測序鑒定后，陽性菌株用1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，用Ni-NTA純化表達(dá)的重組蛋白。結(jié)果表明，重組GP5蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá)。純化后經(jīng)ELISA和Dot-ELISA分析，獲得了能與PRRSV陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與陰性血清不反應(yīng)，具有免疫反應(yīng)性GP5蛋白。 用1%的檸檬酸三鈉還原氯金酸

4、溶液制備均一的15～20nm的納米金顆粒，純化好的GP5蛋白用雙蒸水透析復(fù)性，用納米金包被GP5蛋白，確定最佳包被pH值為9．8，最佳蛋白包被量為40μL，制備的納米金以GP5蛋白包被，每毫升納米金含GP5蛋白0．4mg。通過皮下、肌肉注射免疫6～8周齡ICR小鼠，并以弗氏佐劑和Tris-HCl為對照組，經(jīng)間接ELISA法和MIT法檢測小鼠血清中特異性抗體水平以及脾臟中T、B淋巴細(xì)胞增殖功能。體液檢測結(jié)果表明納米金包被GP5蛋白組能很好