ALV-J gp85真核表達(dá)載體構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、利用真核表達(dá)載體制備DNA疫苗和真核重組亞單位疫苗是臨床生產(chǎn)中防治病毒感染的極具潛力的重要手段，能否利用它們制備出J亞群禽白血病病毒(ALV-J)的具有保護性疫苗抗原尚未見報道。
　　本研究利用PVAX-1載體和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分別構(gòu)建了PVAX1-gp85 DNA表達(dá)載體和pPIC9-gp85蛋白表達(dá)載體;對構(gòu)建的PVAX1-gp85 DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物Hela細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞(CEF)，再與核酸佐劑聯(lián)合免疫雛雞，觀察

2、對血清抗體的誘導(dǎo)效果;對pPIC9-gp85蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至酵母感受態(tài)GS115中，用一定濃度的甲醇誘導(dǎo)，得到特異性gp85重組蛋白;通過多次免疫家兔，制備抗ALV-Jgp85的血清，使用ELISA檢測血清抗體效價和間接免疫熒光試驗(IFA)檢測制備抗體的特異性;同時，利用其作為免疫原聯(lián)合不同佐劑免疫7日齡雛雞，動態(tài)檢測血清抗體以及攻毒后的病毒血癥、免疫器官發(fā)育變化等指標(biāo)分析其免疫保護效果，并經(jīng)體外病毒中和試驗和IFA檢測血清中的中和

3、抗體。
　　試驗結(jié)果表明，(1)PVAX1-gp85真核質(zhì)粒構(gòu)建成功，并能在Hela細(xì)胞和CEF細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，免疫雛雞后誘導(dǎo)產(chǎn)生血清抗體顯著高于對照組和空載體質(zhì)粒免疫組;在整個試驗觀察期，有9只雞只（約82％）產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)，有2只（約27％）始終沒有產(chǎn)生抗體反應(yīng)，病毒血癥檢測免疫保護率為75％。(2)凝膠電泳和基因測序表明用于酵母表達(dá)的pPIC9-gp85重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，Western-blotting結(jié)果證明

4、能夠表達(dá)gp85目的蛋白，使用該蛋白免疫家兔后能產(chǎn)生高效價抗gp85蛋白的血清抗體;使用酵母表達(dá)重組蛋白聯(lián)合兩種佐劑免疫雛雞后，抗體產(chǎn)生比蛋白免疫組要早，且抗體效價高，維持時間長;加強免疫也進一步促進抗體的生成，維持時間進一步延長，抗體陽性率最高達(dá)86％(6/7)和89％(8/9)，對攻毒后的免疫保護率為67％和75％。(3)血清抗體體外病毒中和試驗結(jié)果表明，未用免疫血清中和的三個劑量的ALV-J毒株在細(xì)胞增殖的5d內(nèi)均被檢測出;對較低

5、劑量的（101.625 TCID50或102.625 TCID50）病毒，使用免疫雛雞的抗血清中和后，在5d內(nèi)均未檢測出;對于較高劑量的(103.625 TCID50)病毒，使用不同滴度的抗血清的中和后先后被檢測出，呈現(xiàn)與抗血清滴度明顯的相關(guān)性。通過IFA檢測表明，抗血清中含有中和病毒Ig抗體，證實其對病毒的直接作用。本研究為進一步開展J亞群禽白血病的DNA疫苗和亞單位疫苗的應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其ALV-J疫苗抗原制備提供了新的技