Ad35腺病毒載體構建及病毒蛋白免疫原性研究.pdf

1、目前以C組5型腺病毒(Ad5)載體為基礎構建的腺病毒載體在基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用,但是由于其轉導作用依賴于細胞表面的柯薩奇-腺病毒受體(CAR),許多重要的細胞如造血干細胞和樹突狀細胞表面Ad5吸附受體CAR表達很少,一些惡性腫瘤細胞CAR的表達比相應的正常組織細胞要少,Ad5載體難以轉導外源基因；同時正常人群Ad35的感染率在90％左右,體內(nèi)預存的中和抗體可迅速清除腺病毒載體,導致治療基因消失。這些問題限制了5型腺病毒(Ad

2、5)載體的廣泛應用。為此人們在試圖利用其他型別的腺病毒開發(fā)新型載體,以克服這些不足。
　　 35型腺病毒(Ad35)以幾乎在所有的人類體細胞表面都有表達的CD46作為吸附受體,可以轉導不易被Ad5感染造血細胞、樹突狀細胞和惡性腫瘤細胞等靶細胞。而且世界范圍內(nèi)正常人群中Ad35感染率不到5％,病毒載體被抗體清除的概率小,所以Ad35腺病毒作為頗具吸引力的基因治療載體近年來受到人們的青睞。但目前Ad35載體尚未商品化,且迄今為止僅有

3、的幾例有關成功構建Ad35載體一般采用體外連接法,載體構建過程繁瑣,病毒包裝成功率低。有鑒于此,本文擬利用體外同源重組方法來構建Ad35載體包裝系統(tǒng),以期建立一種操作簡便的Ad35載體系統(tǒng)。
　　 為了評價Ad35載體在實際應用中的可行性,為構建Ad35載體提供可靠的理論依據(jù),本文首先對人6個組10種不同型腺病毒基因組序列同源性進行了比較,發(fā)現(xiàn)人群普遍感染的C組Ad5腺病毒與人群感染率很低的B組Ad35腺病毒在進化上親緣關系比較

4、遠,六鄰體蛋白氨基酸同源性比較顯示Ad5和Ad35六鄰體的同源性只有75.3％,這提示Ad5和Ad35六鄰體之間存在交叉反應的可能性比較??；之后對中國1157份0-80歲健康人群進行了Ad4、Ad5和Ad35抗體水平的本底篩查,結果顯示在中國正常人群感染Ad4和Ad5的比例分別為70％和90％左右,而Ad35的感染要遠遠低于Ad4和Ad5,只有不到5％。
　　 根據(jù)細菌內(nèi)同源重組的原理,克隆了Ad35的全基因組DNA,構建了病毒

5、包裝所需的穿梭質(zhì)粒、骨架質(zhì)粒和表達Ad35腺病毒E1B的細胞系293-E1B,并通過同源重組的方法成功在293-E1B細胞系中包裝出復制缺陷型的Ad35腺病毒,病毒的包裝滴度達到106TCID50/ml,接近于野生型腺病毒。同時還對影響病毒包裝效率的pXI蛋白進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)pXI蛋白是影響重組病毒包裝效率的主要因素。
　　 目前對Ad35的基因組編碼產(chǎn)物研究的還很少,為了闡明Ad35基因組編碼產(chǎn)物中與誘導體液免疫有關的蛋白