泰山松花粉多糖對(duì)重組PRRSV GP5蛋白免疫增強(qiáng)作用的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種高度接觸性的病毒性疾病，發(fā)病率高，死亡率也高，最易感動(dòng)物是妊娠母豬和1月齡內(nèi)的仔豬，主要引起豬的呼吸困難和繁殖障礙性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)階段使用的PRRSV商品化疫苗主要是減毒活疫苗和滅活苗。常用的PRRSV減毒活疫苗存在加速PRRSV毒株變異的風(fēng)險(xiǎn)，而滅活疫苗僅能誘導(dǎo)極其有限的保護(hù)性免疫反應(yīng)。PRRSV亞單位疫苗是PRRS免疫預(yù)防的一個(gè)重要研發(fā)方向，但是亞單位疫苗通常免疫原性較低，

2、因此，篩選針對(duì)PRRSV亞單位疫苗的高效免疫佐劑是提高現(xiàn)有亞單位疫苗免疫效力的重要途徑。本研究以原核表達(dá)的高致病性PRRSV囊膜糖蛋白5（GP5）為免疫原，不同劑量的泰山松花粉多糖（Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharides，TPPPS）作為免疫佐劑，以評(píng)定TPPPS對(duì)GP5蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫增強(qiáng)作用。
　　本研究主要包含以下兩個(gè)部分：
　　1、PRRSV GP5重組質(zhì)

3、粒鑒定與蛋白表達(dá)：將重組質(zhì)粒pET-32a-GP5用PCR、雙酶切進(jìn)行鑒定并測(cè)序，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-32a-GP5轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行原核蛋白的表達(dá)。將表達(dá)的蛋白SDS-PAGE分析得到大小約為32 KD的目的條帶。同時(shí)，Western-Blot鑒定，結(jié)果可清晰看見約32 KD大小的特異性印跡，與SDS-PAGE分析的結(jié)果相一致。然后，將獲得的蛋白通過His標(biāo)簽鎳層析柱進(jìn)行純化。
　　2、

4、泰山松花粉多糖對(duì)重組PRRSV GP5蛋白的免疫增強(qiáng)作用：本研究選取72只SPF昆明小鼠，隨機(jī)分為6組（Ⅰ-Ⅵ）。Ⅰ組注射純化的GP5蛋白，Ⅱ-Ⅳ組分別注射不同濃度的TPPPS（20、40、60 mg/mL）佐劑+GP5蛋白，Ⅴ組注射弗氏佐劑+GP5蛋白，Ⅵ組注射PBS；1周后加強(qiáng)免疫1次。每周隨機(jī)挑選3只小鼠采其外周血，用ELISA檢測(cè)其抗GP5抗體效價(jià)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群的比例，用MTT比色法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，以ELI

5、SA試劑盒分別檢測(cè)IFN-γ、IL-2及IL-4細(xì)胞因子濃度。結(jié)果表明，所有疫苗免疫組小鼠的以上免疫指標(biāo)均有顯著提高，而添加TPPPS和弗氏佐組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于單獨(dú)GP5蛋白接種組。3個(gè)濃度的TPPPS佐劑中，60 mg/mL TPPPS的免疫增強(qiáng)效果最好。本研究表明，PRRSV GP5蛋白誘導(dǎo)了特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，TPPPS佐劑對(duì)GP5蛋白具有理想的免疫增強(qiáng)作用。這為PRRSV GP5蛋白亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)和技術(shù)依托。