泰山松花粉多糖對(duì)畢赤酵母表達(dá)的禽波氏桿菌OmpA的免疫增強(qiáng)效果研究.pdf

1、禽波氏桿菌病是由禽波氏桿菌（Bordetella avium，B. avium）引起的一種家禽上呼吸道性傳染性疾病，既可水平傳播，也可垂直傳播，主要導(dǎo)致死胚率升高，孵化率降低和雛雞的急性死亡。患病雞生長(zhǎng)遲緩、飼料報(bào)酬低，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，本菌還是人體的一種機(jī)會(huì)致病菌。目前，由于藥物殘留的影響以及禽波氏桿菌耐藥性的形成，通過(guò)抗生素治療本病的難度越來(lái)越大。關(guān)于禽波氏桿菌病的預(yù)防，國(guó)外僅對(duì)火雞波氏桿菌病疫苗開(kāi)展了研究。

2、目前用于預(yù)防火雞波氏桿菌病的疫苗包括溫度敏感變異株活菌苗和全細(xì)胞菌素，但這兩種疫苗只能適當(dāng)降低病變的嚴(yán)重程度以及延緩臨床癥狀的出現(xiàn)，并不能從根本上防止本病的傳播。因此急需開(kāi)辟新的途徑，研發(fā)新型疫苗。佐劑可以激活機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)特異性抗原的適應(yīng)性免疫，從而使機(jī)體產(chǎn)生高效持久的免疫反應(yīng)，因此，疫苗佐劑在免疫過(guò)程中是不可或缺的。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，泰山松花粉多糖（Taishan Pinus massoniana polle

3、n polysaccharide，TPPPS）作為滅活疫苗和亞單位疫苗佐劑具有良好的免疫增強(qiáng)效果，但其對(duì)真核表達(dá)的外膜蛋白A（outer membrane protein A，ompA）的免疫效果研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，分泌表達(dá)重組的禽波氏桿菌ompA，采用TPPPS為疫苗佐劑，并評(píng)估其對(duì)重組禽波氏桿菌ompA亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)效果。
　　根據(jù)GenBank中禽波氏桿菌ompA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以

4、實(shí)驗(yàn)室分離得到的禽波氏桿菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后，重組克隆載體進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，膠回收產(chǎn)物連接到相同酶切的表達(dá)載體 pPIC9上，重組表達(dá)載體線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 GS115感受態(tài)細(xì)胞中，RDB板篩選禽波氏桿菌ompA畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定并進(jìn)行基因測(cè)序。同時(shí)，轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pPIC9并篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子作為陰性對(duì)照。
　　采用甲醇

5、誘導(dǎo)法誘導(dǎo)禽波氏桿菌ompA畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分泌表達(dá)ompA，同時(shí)對(duì)空質(zhì)粒畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，作為陰性對(duì)照。于誘導(dǎo)后24、48、72、96 h分別離心收集上清，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot分析進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)鑒定，在SDS-PAGE凝膠中有一條大小為21 kDa的條帶，其分子量大小與目的蛋白分子量大小相一致，而陰性對(duì)照中并沒(méi)有該蛋白條帶。鎳柱純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析只檢測(cè)到一條大小為21 kDa蛋白條帶。

6、Western blot分析中也出現(xiàn)大小為21kDa的特異性條帶，與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果相一致。
　　動(dòng)物試驗(yàn)中，將180只SPF雞隨機(jī)分為6組，3日齡首免，分別頸部皮下接種0.2mL20、40、60mg/mL TPPPS佐劑ompA亞單位疫苗，不完全弗氏佐劑ompA亞單位疫苗，單純的ompA亞單位疫苗和PBS，于首免后7和14d分別進(jìn)行加強(qiáng)免疫。首免后3、7、14、21、28、35、42、49 d，每組隨機(jī)取3只雞采血，并檢

7、測(cè)其血清抗體效價(jià)，血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）濃度，外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分含量，T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。三免后1周，每組（除對(duì)照組）隨機(jī)取20只雞進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)，連續(xù)7d觀察記錄臨床癥狀和存活率。結(jié)果表明，單純的ompA亞單位疫苗能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗-ompA抗體，分泌IL-4，提高CD4+T淋巴細(xì)胞百分含量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，并能提供71.67％的保護(hù)率。此外，TPPPS佐劑疫苗能顯著提高機(jī)體免疫反應(yīng)水平，且60mg/m