泰山松花粉多糖對禽波氏桿菌DNA疫苗的免疫增強作用.pdf

1、禽波氏桿菌病是一種新型細菌性傳染病，其病原體為禽波氏桿菌，主要造成雛禽的呼吸道疾病，引起急性死亡?；疾‰u群生長緩慢，飼料報酬率低，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前國內(nèi)外用于預防該病所用的疫苗主要有禽波氏桿菌溫度敏感株和全細胞菌素，但疫苗保護效果一般，僅能適當降低病變的嚴重程度或延緩臨床癥狀的出現(xiàn)，亟待研發(fā)新型疫苗。而DNA疫苗是一種最新的分子水平的生物技術(shù)疫苗，能夠同時誘導機體產(chǎn)生全面的體液免疫反應和細胞免疫反應，因此在實踐應用中備受

2、人們關(guān)注。此外，本實驗室從2003年開始對泰山松花粉多糖(TPPPS)進行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖作為疫苗佐劑能夠顯著提高滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果，然而以泰山松花粉多糖作為DNA疫苗佐劑尚未被研究。因此，為研發(fā)新型有效的禽波氏桿菌疫苗，本課題選取禽波氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因為目的基因構(gòu)建真核重組表達質(zhì)粒并制備DNA疫苗。為提高DNA疫苗的免疫效果，我們選取泰山松花粉多糖作為疫苗佐劑同時評估其對DNA疫苗的免疫調(diào)節(jié)

3、作用。
　　根據(jù)NCBI發(fā)表的禽波氏桿菌OmpA基因設計一對特異性引物，對實驗室分離得到的禽波氏桿菌菌株的OmpA基因進行PCR擴增并連接到pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化并送至測序公司測序。用EcoRⅠ與XhoⅠ酶切處理pMD18-T-OmpA質(zhì)粒獲得OmpA基因并將得到的OmpA基因連接到已用EcoRⅠ與XhoⅠ處理的pVAX1質(zhì)粒上，將重組質(zhì)粒進行雙酶切檢測與測序。
　　將驗證構(gòu)建正確的重組真核質(zhì)粒pVAX1-OmpA轉(zhuǎn)染BH

4、K-21細胞，72 h后收獲細胞上清液獲得表達的OmpA蛋白。將獲得的OmpA蛋白通過His標簽鎳柱層析法進行純化，純化的OmpA蛋白的SDS-PAGE分析顯示目的條帶大小約為27 KD，與預期結(jié)果相符。同時，OmpA蛋白的Western blotting鑒定可清晰地看見約27 KD大小的特異性條帶，與其SDS-PAGE分析結(jié)果相一致。
　　依照本實驗室改進的水提醇沉法提取泰山松花粉多糖，并將大量提取的重組質(zhì)粒與泰山松花粉多糖或弗

5、氏不完全佐劑等體積配比制備疫苗。將224只1日齡SPF雛雞隨機分為7組，于1、7、14日齡時，每組每只雛雞分別注射等量的3個不同多糖濃度(50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL)的DNA疫苗、弗氏佐劑DNA疫苗、純DNA疫苗、空質(zhì)粒和PBS。在首次免疫后的第7、14、21、28、35、42、49天每組隨機選取3只雛雞采血檢測其血清抗體效價、白細胞介素-2(IL-2)含量、白細胞介素-4(IL-4)含量、干擾素-γ(IF

6、N-γ)含量，外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量水平。同時，在三次加強免疫后每組隨機選取20只進行攻毒保護試驗，連續(xù)7天記錄雞群生存狀態(tài)并統(tǒng)計免疫保護率。結(jié)果顯示，禽波氏桿菌OmpA DNA疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體、提高細胞因子分泌量和外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)，并為雛雞提供50％的免疫保護。另外，泰山松花粉多糖和弗氏佐劑能夠顯著提高雛雞體液免疫和細胞免疫水平且200 mg/mL的松花粉多糖效果最優(yōu)(P＜0.05)。