表達(dá)PRRSV GP5蛋白的重組偽狂犬病毒的免疫效力研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起，主要表現(xiàn)為妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病，死亡率增加，飼料報酬率降低。該病傳播速度極快，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一個重要傳染病。疫

2、苗免疫是控制該病發(fā)生的一個有效辦法，但目前現(xiàn)有疫苗存在許多不足，如PRRSV滅活疫苗免疫劑量大，接種次數(shù)多，不能激發(fā)黏膜免疫，保護(hù)效果不確實(shí)；弱毒疫苗雖然可以形成有效的臨床保護(hù)，但和滅活疫苗一樣不能阻止野毒感染，且存在著散毒和毒力返強(qiáng)之憂。所以利用生物技術(shù)手段開發(fā)能夠激發(fā)黏膜免疫并能通過血清學(xué)方法區(qū)分野毒感染的安全和有效的新型PRRS疫苗，來控制在我國日益泛濫的PRRS，是廣大養(yǎng)豬企業(yè)的迫切需要。 為了研制更安全、有效的PRRS

3、新型疫苗，為此我們構(gòu)建了以偽狂犬病毒(Pseudorabies virus PRV)弱毒疫苗。Bartha-K61株為載體表達(dá)PRRSV CH-1a株GP5的重組偽狂犬病毒(rPRV-GP5)。本研究以BALB/c小鼠為動物模型評價rPRV-GP5免疫小鼠后對PRRSV所產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答并進(jìn)一步在豬上進(jìn)行了試驗。 為了研究表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的重組偽狂犬病毒(rPRV-GP5)免疫動物后能否產(chǎn)生

4、針對PRRSV特異性的免疫應(yīng)答。100只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，rPRV-GP5組60只，親本株Bartha-K61組20只，陰性對照組20只，rPRV-GP5與Bartha-K61組每只鼠滴鼻接種10<'50>TCID<,50>病毒，接種后rPRV-GP5組每周隨機(jī)處死6只小鼠，Bartha-K61組2只，空白2只。分離脾細(xì)胞，采用RT-PCR方法分析經(jīng)PRRSV刺激后脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗；

5、收集肺、腸、糞便沖洗液和血清，采用間接免疫熒光法檢測其中特異性抗GP5的IgA和IgG抗體。試驗結(jié)果表明，rPRV-GP5免疫組在第4周可檢測到針對GP5的IgA和IgG抗體，抗體可分別持續(xù)到第7周和第10周。接種后6周的rPRV-GP5組脾細(xì)胞在體外特異性抗原刺激下，在培養(yǎng)第16小時可檢測到高表達(dá)的IFN-γ，24小時后表達(dá)量逐漸減少，而IL-4在整個刺激培養(yǎng)過程中表達(dá)水平明顯低于IFN-γ。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)果顯示在第8周rPRV-

6、GP5免疫組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)要顯著高于Bartha-K61免疫組和對照組(P<0.05)。以上結(jié)果表明表達(dá)PRRSV GP5的重組偽狂犬病毒可以有效的刺激小鼠產(chǎn)生針對PRRSV的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。為了研究rPRV-GP5對豬預(yù)防PRRS的安全性和免疫原性，4-5周齡。PRV中和抗體和PRRSV ELISA抗體為陰性的仔豬15頭隨機(jī)分成3組，一組為rPRV-GP5免疫組，滴鼻10<'7.0>PFU/頭；第二組為偽狂犬病Bartha

7、-K61活疫苗組滴鼻10<'7.0>PFU/頭；第三組為空白對照組。免疫后每周采凝血，收集血清；第4、5、6、7周采集肝素抗凝血，分離PBMC，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗。結(jié)果顯示rPRV-GP5免疫組在第4周可檢測到針對GP5 IgG的熒光抗體，但第7周以后便檢測不到，中和抗體直到實(shí)驗結(jié)束都未檢測到。將免疫后6周分離的仔豬PBMC轉(zhuǎn)入6孔板中用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。每孔加入200μl毒價為10<'5.0>TCID<,50

8、>/ml豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)CH-1a株刺激培養(yǎng)，在24、48、72h收獲培養(yǎng)上清。結(jié)果顯示rPRV-GP5免疫組和空白組細(xì)胞上清IL-10含量較刺激前顯著升高，IFN-γ的含量在24h到達(dá)峰值且較空白組顯著升高(P<0.05)。而淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)果顯示在第4、5周rPRV-GP5免疫組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)要顯著高于Bartha-K61免疫組和對照組(P<0.05)。 以上結(jié)果表明rPRV-GP5免疫BALB/c小