嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體msp2、msp4蛋白的原核表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體是經(jīng)蜱傳播的專性的革蘭氏陰性小球桿菌,還是重要的人獸共患病病原體,不僅可以感染人,也可以感染牛羊反芻動(dòng)物,及馬和狗等家養(yǎng)動(dòng)物。自20世紀(jì)90年代初于美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),澳洲、歐洲多國(guó)、韓國(guó)及我國(guó)先后均有報(bào)道,且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。由于該病的臨床多表現(xiàn)為急性不明原因發(fā)熱,肌肉痛,乏力,頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀,臨床缺乏對(duì)該病的足夠認(rèn)識(shí),也缺乏相應(yīng)的快速診斷方法,因此該病及易發(fā)生誤診,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能衰竭,甚至死亡,所

2、以對(duì)該病的確診就要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行診斷,目前應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有IFA、急性期的血液涂片檢查、巢氏PCR、直接對(duì)病原的分離培養(yǎng)。但是免疫熒光方法(IFA)不僅需要特殊儀器如熒光顯微鏡,還需要等到恢復(fù)期采集第二次血液標(biāo)本。病原體分離培養(yǎng)診斷十分可靠,但分離率低且耗時(shí)。以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)可以取代分離培養(yǎng)進(jìn)行病原體檢測(cè),但需要特殊的儀器及具備一定實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人員才能完成。因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便的靈敏性的高特異性的檢測(cè)方法對(duì)于該病

3、原體的診斷是很有必要的。
　　嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是無(wú)形體的特征性的蛋白家族,該家族基因包含3個(gè)OMP1、1個(gè)msp2、2個(gè)msp2同源基因、1個(gè)msp4、113個(gè)p44 loci基因,可以作為診斷該病原的選擇依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選取了 msp2及msp4兩個(gè)主要表面蛋白作為研究的對(duì)象,對(duì)E-msp2、N-msp4、Z-msp4三個(gè)主要表面蛋白的全長(zhǎng)基因進(jìn)行原核表達(dá),分別構(gòu)建了pET32a、pET28a、

4、pGEX-4T-1三個(gè)原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)全長(zhǎng)序列均未能在原核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),通過(guò)查閱文獻(xiàn)顯示可能與信號(hào)肽的存在有關(guān)聯(lián);進(jìn)而對(duì)三個(gè)全長(zhǎng)序列進(jìn)行信號(hào)肽的分析,結(jié)果顯示在三個(gè)全長(zhǎng)的序列的N端都存在信號(hào)肽序列,信號(hào)肽序列影響其原核表達(dá)。
　　通過(guò)對(duì)三個(gè)全長(zhǎng)序列的生物信息學(xué)的分析,在去除信號(hào)肽的前提基礎(chǔ)上,選取了富含抗原表位區(qū)的序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和原核表達(dá)載體的構(gòu)建,并在原核細(xì)胞中成功表達(dá)目的蛋白,證明信號(hào)肽序列影響了全長(zhǎng)

5、序列在原核中的表達(dá)。在pET32a原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)后,三個(gè)蛋白的主要表達(dá)的形式是包涵體形式,通過(guò)親和層析方法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)WB驗(yàn)證三個(gè)重組蛋白的免疫原性。
　　利用原核表達(dá)的重組蛋白建立了ELISA檢測(cè)方法,抗原在4℃過(guò)夜條件下包被,包被濃度為100μg/mL,待檢血清稀釋倍數(shù)為1:200,5％的脫脂奶粉37℃封閉1h,酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1:5000,底物顯色10min,利用重組蛋白與羊布魯氏菌、羊萊姆病陽(yáng)性血