HIV-1 MA蛋白的表達(dá)純化及免疫原性的初步研究.pdf

1、HIV-1基質(zhì)蛋白在病毒的組裝、出芽等方面起重要的作用。而且比較保守，變異發(fā)生率低，而且是細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶抗原，能夠產(chǎn)生較好的免疫效果。
　　 本研究以保藏菌株質(zhì)粒pNL4-3為模板，在引物設(shè)計(jì)時(shí)加入TAA終止密碼子，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得艾滋病病毒MA蛋白編碼序列，含有399 bp，編碼132個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)分子量大約為17 kD，等電點(diǎn)為9.27。把帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的MA編碼序列克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(

2、+)中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET028a-ma，經(jīng)PCR鑒定、雙酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)粒正確。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，37℃時(shí)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，將菌體裂解，作聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，與陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比在20 kD附近有一條特異性蛋白質(zhì)條帶，MA蛋白17 kD融合載體His標(biāo)簽3.56 kD，說(shuō)明目的蛋白MA成功表達(dá)，大小與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。
　　 表達(dá)的融合蛋白是可溶的，菌體裂解后存在于上清中。利用

3、金屬鎳親和層析的方法初純化蛋白。再經(jīng)過凝膠過濾層析，離子交換層析純化后可以獲得較純的蛋白質(zhì)，經(jīng)過MALDI-TOF MS鑒定其為帶有His標(biāo)簽的MA蛋白。將純化后的融合蛋白與免疫佐劑混合后，分四次免疫新西蘭雄兔，獲得特異性較強(qiáng)的多克隆抗體，并利用原核表達(dá)的融合蛋白制備抗原親和層析柱對(duì)抗體進(jìn)行純化。獲得純度及特異性較好的抗體，用于目的蛋白MA真核表達(dá)的鑒定純化。
　　 在真核方面，把帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的MA編碼序列克隆到供體質(zhì)粒pF

4、astBac1中，并且鑒定重組成功；用供體質(zhì)粒pFastBac1-ma轉(zhuǎn)化DH10Bac，通過藍(lán)白斑篩選獲得重組的Bacmid-ma，利用PCR的方法和測(cè)序鑒定，說(shuō)明重組成功。提取重組的Bacmid-ma基因組，用其轉(zhuǎn)染家蠶卵巢上皮細(xì)胞，待細(xì)胞發(fā)病后；經(jīng)過PCR鑒定，獲得重組有MA編碼序列的桿狀病毒。發(fā)病細(xì)胞經(jīng)過傳代后，用自制的兔多克隆抗體為一抗，Western blotting鑒定目的蛋白MA在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，并且不帶有任