人嗜吞噬細胞無形體Msp2、Ats-1蛋白與宿主細胞潛在蛋白互作研究.pdf

1、人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是一種新發(fā)蜱傳人獸共患傳染病,發(fā)病病原嗜吞噬細胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)是一種專性胞內(nèi)寄生菌,革蘭氏陰性,可寄居于哺乳動物細胞中,也可生活在硬蜱中并傳播。人粒細胞是嗜吞噬細胞無形體生存、繁殖的重要場所。HGA臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、頭痛、肌痛、白細胞減少和血小板減少、肝酶活性水平升高等,與某些病毒性傳染病極其相似,極易發(fā)

2、生誤診,重癥者可引起死亡。家畜(馬、犬和反芻動物)粒細胞無形體病臨床癥狀跟HGA基本相似。嗜吞噬細胞無形體經(jīng)蜱叮咬進入機體后主要存在于粒細胞中,形成含菌包涵體,且不會被溶酶體融合,擾亂宿主細胞免疫功能,有利于胞內(nèi)生長繁殖。嗜吞噬細胞無形體侵入粒細胞過程中,其表面膜蛋白最先與宿主細胞發(fā)生相互作用,完成細菌侵入機體的黏附內(nèi)吞過程;嗜吞噬細胞無形體進入粒細胞后,一些分泌蛋白、包涵體膜蛋白等對病原的包內(nèi)寄居有重要作用,但其分子致病機理尚不完全清

3、楚。近年來粒細胞無形體病特別是HGA案例世界范圍內(nèi)有增加趨勢,引起世界各國的廣泛關注。我們對我國人粒細胞無形體病(HGA)流行病學進行了調(diào)查,臨床表現(xiàn)為重癥型。本文擬對我國部分地區(qū)無形體病流行情況進行調(diào)查,并對人粒細胞無形體致病過程中的表面蛋白、分泌蛋白作用進行了探討。本研究開展如下工作:
　　1.了解云南曲靖、山西呂梁兩省/市鼠傳無形體流行特征。無菌條件下收集的鼠脾臟樣本用組織破碎儀破碎后試劑盒抽提基因組,巢式 PCR檢測疑似陽

4、性產(chǎn)物送測序并進行序列信息分析。研究結果表明,云南曲靖優(yōu)勢鼠種為褐家鼠和黃胸鼠,立克次體總陽性率為1.7％,細菌有立克次體屬(Rickettsia)、埃立克體屬(Ehrlichia)、無形體屬(Anaplasma)、沃爾巴克體屬(Wolbachia)等多個種屬,提示中國云南曲靖鼠類自然感染病原種類較復雜,變異較大。山西呂梁優(yōu)勢鼠種為黑線姬鼠,立克次體總陽性率為5.9%,立克次體種類僅有查菲埃立克體(Ehrlichia chaffeens

5、is)。由此得出結論是云南曲靖、山西呂梁兩地區(qū)嚙齒動物中存在立克次體自然感染現(xiàn)象,嚙齒動物可能是該地區(qū)立克次體病原的一個自然疫源宿主。
　　2.構建人單核細胞白血病細胞(THP-1)cDNA文庫。提取人單核細胞白血病細胞THP-1總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA, LD-PCR擴增獲得雙鏈cDNA,用CHROMA SPIN+TE-400純化柱純化的雙鏈cDNA與pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y187,構建cDNA文庫。得

6、到了人THP-1細胞cDNA文庫的庫容為4.0×106,重組率為96.1%,插入片段大小在100-3000bp,且片段條帶豐度位于500-2000bp之間,已達到建庫要求。為進一步篩選與嗜吞噬細胞無形體 LZ-HGA-Agent MSP2蛋白、Ats-1蛋白相互作用的THP-1細胞潛在蛋白奠定了基礎。
　　3.篩選與中國人源嗜吞噬細胞無形體分離株LZ-HGA-Agent Msp2、Ats-1相互作用的人THP-1細胞潛在靶蛋白,為

7、無形體分子致病機理研究提供實驗數(shù)據(jù)。以中國人源嗜吞噬細胞無形體分離株LZ-HGA-Agent表面膜蛋白Msp2、分泌蛋白 Ats-1和人THP-1細胞為主要研究對象,通過生物信息學分析,選擇編碼Msp2蛋白完整開放閱讀框、Ats-1蛋白部分開放閱讀框作為克隆目標,通過引物設計,PCR擴增目的基因 msp2、ats-1,連接等構建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-msp2、pGBKT7-ats-1并轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株,最后經(jīng)自激活檢測和毒性檢

8、測證實成功構建含誘餌質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子;采用研究蛋白-蛋白互作的酵母雙雜交經(jīng)典技術篩選互作蛋白。以上研究結果表明,篩選到與表面蛋白 Msp2互作的THP-1細胞潛在蛋白主要有NADH脫氫酶(泛醌)1α亞體13(NDUFA13)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)、核糖體蛋白L11(RPL11)、前胸腺素α(PTMA)、Homo sapiens chromosome19 open reading frame10(C19orf10)、

9、組織蛋白酶G(CTSG)、核糖體蛋白S25(RPS25)七個陽性潛在蛋白,而與分泌蛋白Ats-1互作的THP-1細胞潛在蛋白主要有真核翻譯延伸因子1α1亞基(EEF1A1)、金屬蛋白酶抑制子1(TIMP1)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、前胸腺素α(PTMA)、Homo sapiens Williams Beuren syndrome chromosome region22(WBSCR22)

10、、吸引素(ATRN)七個陽性潛在蛋白。
　　4.鑒定與Msp2、Ats-1蛋白真正互作的靶蛋白。為了進一步鑒定篩選到的中國人源嗜吞噬細胞無形體分離株表面蛋白Msp2、分泌蛋白Ats-1互作的THP-1細胞真正潛在蛋白,利用免疫共沉淀技術、Western blot技術驗證部分互作蛋白。研究結果表明,最終驗證嗜吞噬細胞無形體分離株表面蛋白Msp2與THP-1細胞的組織蛋白G(CTSG)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)蛋白發(fā)

11、生相互作用;分泌蛋白Ats-1與THP-1細胞的半乳糖凝集素1(LGALS1)、金屬蛋白酶抑制子1(TIMP1)蛋白發(fā)生相互作用。
　　總之,本研究檢測到云南曲靖、山西呂梁鼠類中立克次體病原分布情況,證實了云南曲靖地區(qū)存在多種立克次體病原,研究結果可以為上述兩地區(qū)立克次體病防控提供指南;同時本研究成功篩選到中國人源嗜吞噬細胞無形體分離株Msp2、Ats-1蛋白相互作用的THP-1潛在蛋白,這些潛在蛋白可能跟中國人源嗜吞噬細胞無形體