家蠶類泛素化修飾蛋白的鑒定及BmNPV早期蛋白PE38與宿主互作蛋白的研究.pdf

1、眾所周知，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTMs）在很大程度上決定了蛋白質(zhì)的活性、功能發(fā)揮、細(xì)胞定位、穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)之間的相互作用等一系列生物學(xué)功能，在機(jī)體受到外界刺激時(shí)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能起著精細(xì)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而有助于機(jī)體針對外源刺激產(chǎn)生快速有效的反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)存在多種蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控方式，如泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等等，它們都對細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生物學(xué)功能有著至關(guān)重要的作用。小類泛素蛋白相關(guān)修飾物（SUMO）分子是一種新發(fā)現(xiàn)的類泛素分子，雖

2、然它的氨基酸序列與泛素只有約18％的相似性，但是它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似，在功能上它同樣參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾。已有研究表明，蛋白質(zhì)的類泛素化（SUMO化）修飾作為一種重要的且可逆的翻譯后水平調(diào)節(jié)機(jī)制，其參與了細(xì)胞周期調(diào)控、核質(zhì)運(yùn)輸、蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白互作和轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)等很多非常重要的細(xì)胞生物學(xué)過程。
　　家蠶是目前唯一一種可以大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)昆蟲，家蠶核型多角體病毒（BmNPV）病（即家蠶血液型膿?。┦丘B(yǎng)蠶業(yè)上最常見且危害

3、最嚴(yán)重的蠶病之一，每年國內(nèi)因感染BmNPV而引起的家蠶血液型膿病在蠶桑業(yè)生產(chǎn)上都會(huì)造成比較大的損失。BmNPV是引起家蠶血液型膿病的病原體，主要寄生在血細(xì)胞和體腔內(nèi)各種組織的細(xì)胞核中。BmNPV極早期蛋白基因 pe38在病毒侵染早期起到極其重要的作用，PE38分子量大小為38kDa，通過亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)其主要集結(jié)在細(xì)胞核周圍的點(diǎn)狀區(qū)域，進(jìn)一步對PE38蛋白的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其N末端附近包含一個(gè)核定位信號(hào)，中間部位擁有一個(gè)RING(C3H

4、C4) finger結(jié)構(gòu)，還有個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域位于其C末端附近。已有研究證實(shí)在缺失 pe38的情況下，病毒的DNA合成水平會(huì)明顯降低甚至還會(huì)極大地降低病毒對宿主的侵染性。
　　本研究通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Bac-to-Bac、昆蟲細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、Western Blot以及LC-ESI-MS/MS質(zhì)譜分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從家蠶BmN細(xì)胞以及BmNPV中總共篩選出68種家蠶蛋白和14種BmNPV蛋白可能是SUMO化修飾底物。隨后分別從基因

5、的分子功能、細(xì)胞組成成分和參與的生物過程三個(gè)方面進(jìn)行GeneOntology注釋，結(jié)果顯示68種家蠶蛋白中有59種能夠被匹配到GO中，基因的分子功能條目下，48.15%和35.8%的蛋白分別參與結(jié)合和催化活性；細(xì)胞組成成分條目下，21.56%，21.56%和16.5%的蛋白分別被歸類為細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞器；參與的生物過程條目下，19.39%，16.48%，9.2%和8.05%蛋白分別參與細(xì)胞內(nèi)加工、代謝、單有機(jī)體加工和生物調(diào)節(jié)生命過程

6、。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述所篩選出的SUMO化修飾底物蛋白確實(shí)是被SUMO蛋白所修飾，利用果蠅表達(dá)載體pMT/V5-His B完成SUMO化修飾底物候選蛋白以及SUMO蛋白在果蠅S2細(xì)胞中的共表達(dá)，免疫共沉淀分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所選候選蛋白均可被SUMO蛋白所修飾。
　　另一方面，研究團(tuán)隊(duì)先前利用酵母雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)從家蠶中腸 cDNA文庫中篩選出與BmNPV PE38蛋白相互作用的宿主蛋白編碼基因（如編碼家蠶絲氨酸蛋白酶、過氧化氫

7、酶、家蠶翻譯延伸因子2等基因）。在此我們進(jìn)一步應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)成功地反向驗(yàn)證了BmNPV PE38與宿主家蠶Bm eIF4E、Bm SRPK之間的相互作用。此外，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了BmNPV侵染家蠶BmN細(xì)胞各個(gè)時(shí)期中Bm eIF4E,Bm srpk的特異性差異表達(dá)，結(jié)果顯示在病毒侵染早期（12-24 h）Bm eIF4E,Bm srpkmRNA的表達(dá)量均有明顯的上調(diào)，但是在侵染后期（48 h后）二者mRNA水平的表達(dá)量急劇