家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26及其宿主互作蛋白的研究.pdf

1、微孢子蟲是一類專營細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物,具有廣泛的寄主域,包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物。家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)是引起家蠶微粒子病的病原體,可以通過胚胎垂直傳播,被蠶業(yè)生產(chǎn)國列為唯一的法定檢疫對象。目前,微粒子病依然給我國和印度兩個(gè)蠶絲大國的蠶絲業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自19世紀(jì)中期首次發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲以來,人們對微孢子蟲的研究已有150多年的歷史。成熟孢子是微孢子蟲唯一在細(xì)胞外的生活階段,其外被厚厚的孢子壁。孢子壁

2、的存在可以使成熟微孢子蟲抵抗外界任何不良環(huán)境,使其在惡劣環(huán)境中生存很長時(shí)間。微孢子蟲的孢壁位于孢子的最外層,主要由高密度電子層的蛋白質(zhì)成分的孢子外壁和低電子密度的蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)成分的孢子內(nèi)壁組成。堅(jiān)硬的孢子壁不但可以保護(hù)孢子抵抗各種外界壓力,而且在維持微孢子蟲孢內(nèi)滲透壓的平衡中也起著重要作用。最近研究表明,位于微孢子蟲孢壁結(jié)構(gòu)的一些孢壁蛋白在微孢子蟲的侵染機(jī)制和孢子黏附的過程中扮演著重要的角色。SWP26是一種C-端含有一個(gè)肝素結(jié)合基序

3、的家蠶微孢子蟲孢壁蛋白,肝素結(jié)合基序能識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的葡聚糖,從而介導(dǎo)孢子粘附和宿主細(xì)胞的感染。免疫膠體金標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn),孢壁蛋白SWP26在成熟孢子與未成熟孢子中均有表達(dá),在孢壁的發(fā)育過程中孢子內(nèi)外壁也均有SWP26蛋白的分布。這暗示著,家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26在孢子壁的形成過程以及孢子黏附和宿主細(xì)胞的侵染過程中可能扮演著重要的角色。
　　本文通過家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26的時(shí)相表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),家蠶中腸組織在感染

4、微孢子蟲后的24h就可以檢測到SWP26的轉(zhuǎn)錄本,表明該孢壁蛋白可能在孢子裂殖體階段就需要發(fā)揮作用,這與SWP26在家蠶微孢子蟲不同發(fā)育階段的亞細(xì)胞定位相一致。然而,目前對家蠶微孢子蟲SWP26與其宿主蛋白之間的分子作用依然知之甚少。在此,我們希望通過實(shí)驗(yàn)去了解孢壁蛋白SWP26與宿主蛋白之間是否存在著直接的相互作用。
　　試驗(yàn)中我們利用家蠶核型多角體病毒Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng),將家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26基因和綠色熒光

5、蛋白報(bào)告基因EGFP克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1,并轉(zhuǎn)化DHI0BmBac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)同源重組獲得重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒vBmEGFP-SWP26,隨后將其轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN獲得含有目的基因的重組桿狀病毒。用SDS-PAGE和Western-blot方法在感染重組病毒的家蠶BmN細(xì)胞中檢測到大小約51kDa的重組蛋白條帶。結(jié)果表明,家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26基因可在BmN細(xì)胞中成功表達(dá),這為繼續(xù)研究其功能以及在細(xì)胞水平通

6、過免疫共沉淀方法篩選與之互作的宿主蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　隨后,利用EGFP作為抗原決定簇通過免疫共沉淀技術(shù)篩選與之相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),我們篩選到一個(gè)與SWP26有相互作用的家蠶類海龜?shù)鞍?Bombyxmoriturtle-likeprotein,BmTLP)。經(jīng)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP26與家蠶類海龜?shù)鞍譈mTLP之間的確存在相互作用。完整家蠶類海龜?shù)鞍组_放式閱讀框長1344bp,

7、編碼447個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子量大小約為49.6kDa,等電點(diǎn)為5.55,在其N-端有一段長為27個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列,27和28氨基酸位點(diǎn)之間為裂解位點(diǎn)。通過在線BLASTp比對分析發(fā)現(xiàn),BmTLP蛋白與相應(yīng)鱗翅目昆蟲大紅斑蝶(Danausplexippus)海龜?shù)鞍仔蛄械耐葱愿哌_(dá)98％(基因登錄號(hào):EHJ71750),與膜翅目模式昆蟲黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)海龜?shù)鞍仔蛄械耐葱砸策_(dá)到了84%(

8、基因登錄號(hào):ACN43741)。經(jīng)在線軟件NetNGlyc1.0預(yù)測該cDNA所編碼的氨基酸序列具有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn),推測BmTLP蛋白很可能是一種分泌型的糖蛋白。SMART軟件分析結(jié)果表明,BmTLP蛋白具有免疫球蛋白超家族(ImmunoglobulinSuperfamily,IgSF)的一般特征,含有兩個(gè)IG結(jié)構(gòu)域(氨基酸位點(diǎn):34–145和342–428)和兩個(gè)IGc2結(jié)構(gòu)域(氨基酸位點(diǎn):161–226和252–321),

9、屬于典型的類免疫球蛋白家族成員。我們發(fā)現(xiàn)BmTLP蛋白與家蠶先天性免疫球蛋白–hemolin(編碼序列:BGIBMGA008736-TA;蛋白序列:BGIBMGA008736-PA;基因登錄號(hào):DQ096295)擁有相同的蛋白功能結(jié)構(gòu)域,但是他們的分布位置有很大差異。在BmTLP蛋白中兩個(gè)IGc2結(jié)構(gòu)域位于兩個(gè)IG結(jié)構(gòu)域的中間,而hemolin蛋白與之相反。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,接種家蠶微孢子蟲后12h,家蠶中腸組織中