家蠶微孢子蟲(chóng)假定層粘連蛋白NbHLAMA2、NbHLAMB4的研究.pdf

1、微孢子蟲(chóng)（microsporidia）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核單細(xì)胞生物，具有廣泛的寄主域，包括昆蟲(chóng)、魚(yú)類和人類。家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）是引起家蠶微粒子病的病原，可以經(jīng)食下和胚種兩種途徑傳染，常給蠶業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然有關(guān)家蠶微孢子蟲(chóng)的研究取得了較大的進(jìn)展，但對(duì)其侵染致病的分子機(jī)制仍然沒(méi)有完全弄清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲(chóng)在激活前，會(huì)通過(guò)特殊的機(jī)制與宿主細(xì)胞接近并粘附在宿主細(xì)胞上，且微孢子蟲(chóng)的這種粘附作

2、用與宿主細(xì)胞的感染有一定關(guān)系。作為孢子最早、最直接與宿主接觸的部分，微孢子蟲(chóng)表面蛋白在微孢子蟲(chóng)侵染宿主的過(guò)程中起到重要作用。層粘連蛋白是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分之一，在基膜的構(gòu)建及細(xì)胞的粘附等方面都有重要的作用。本研究以微孢子蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)為依據(jù)，通過(guò)檢索相似物種的層粘連蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲(chóng)基因組存在層粘連蛋白基因的同源序列，以兩個(gè)假定的層粘連蛋白α、β亞基（NbHLAMA2、NbHLAMB4）為研究對(duì)象，克隆、分析了其序列特征，通過(guò)實(shí)

3、時(shí)熒光定量 PCR的方法分析了其轉(zhuǎn)錄活性，并進(jìn)一步通過(guò)分子克隆、原核表達(dá)，制備了相應(yīng)的多克隆抗體。利用免疫膠體金技術(shù)分析了NbHLAMA2在家蠶微孢子蟲(chóng)中的亞細(xì)胞定位，體外宿主細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和抗體封閉實(shí)驗(yàn)研究了NbHLAMA2與孢子粘附宿主細(xì)胞的關(guān)系。通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，以NbHLAMB4作為誘餌蛋白，在家蠶中腸cDNA文庫(kù)中篩選到與NbHLAMB4相互作用的候選蛋白質(zhì)。主要研究結(jié)果如下：
　　1. NbHLAMA2、NbHLAMB

4、4的克隆及序列分析
　　本研究成功地克隆了家蠶微孢子蟲(chóng)假定層粘連蛋白基因 NbHLAMA2、NbHLAMB4，序列分析結(jié)果顯示：NbHLAMA2的開(kāi)放閱讀框?yàn)?704bp，不具有內(nèi)含子，該基因編碼的蛋白質(zhì)含有568個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為67.80 kD，等電點(diǎn)為7.99；NbHLAMB4的開(kāi)放閱讀框?yàn)?104bp，不具有內(nèi)含子，該基因編碼的蛋白質(zhì)含有367個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為43.74kD，等電點(diǎn)為5.72。NbHL

5、AMA2和NbHLAMB4編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，除了僅有一些糖基化位點(diǎn)之外，只含有一些卷曲螺旋和低復(fù)雜度基序，均無(wú)信號(hào)肽也無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。此外，NbHLAMA2與NbHLAMB4的氨基酸序列相似性為41％，E值為0.23。
　　2. NbHLAMA2、NbHLAMB4的轉(zhuǎn)錄特征分析
　　分別提取感染家蠶微孢子蟲(chóng)后不同時(shí)期的家蠶中腸總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉(zhuǎn)

6、錄情況。結(jié)果顯示，自感染家蠶微孢子蟲(chóng)6h起便可以檢測(cè)到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉(zhuǎn)錄本，且之后各時(shí)期均可檢測(cè)到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉(zhuǎn)錄，這暗示了 NbHLAMA2、NbHLAMB4可能在家蠶微孢子蟲(chóng)侵染及增殖過(guò)程中均發(fā)揮一定的作用。
　　3. NbHLAMA2、NbHLAMB4的原核表達(dá)及抗體制備
　　通過(guò)分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體 pET30a-NbHLAMA2和pET28a-N

7、bHLAMB4，并將之轉(zhuǎn)化E. coliBL21（DE3）進(jìn)行融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，獲得NbHLAMA2及NbHLAMB4重組蛋白。利用純化的蛋白免疫動(dòng)物，制備了相應(yīng)的多克隆抗體。
　　4. NbHLAMA2的定位分析及功能初探
　　通過(guò)免疫膠體金技術(shù)，對(duì)NbHLAMA2在家蠶微孢子蟲(chóng)成熟孢子中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，結(jié)果顯示NbHLAMA2主要定位在成熟孢子的孢子壁，同時(shí)在孢子內(nèi)部也有分布。宿主細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和抗體封閉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

8、：NbHLAMA2蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合到宿主細(xì)胞表面且抗體封閉后孢子粘附率下降，推測(cè)NbHLAMA2蛋白在孢子與宿主細(xì)胞的粘附過(guò)程中發(fā)揮一定作用。
　　5.應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選NbHLAMB4互作蛋白
　　應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，以NbHLAMB4作為誘餌蛋白，從家蠶中腸cDNA文庫(kù)中初步篩選得到了3個(gè)可能與NbHLAMB4相互作用的候選蛋白（熱休克蛋白、鋅指蛋白420類似物、氨肽酶N）。研究結(jié)果對(duì)理解NbHLAMB4在家蠶微孢