家蠶微孢子蟲假定層粘連蛋白NbHLAMA2、NbHLAMB4的研究.pdf

1、微孢子蟲（microsporidia）是一類專性細胞內寄生的真核單細胞生物，具有廣泛的寄主域，包括昆蟲、魚類和人類。家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）是引起家蠶微粒子病的病原，可以經食下和胚種兩種途徑傳染，常給蠶業(yè)生產造成巨大的經濟損失。雖然有關家蠶微孢子蟲的研究取得了較大的進展，但對其侵染致病的分子機制仍然沒有完全弄清楚。有研究發(fā)現，微孢子蟲在激活前，會通過特殊的機制與宿主細胞接近并粘附在宿主細胞上，且微孢子蟲的這種粘附作

2、用與宿主細胞的感染有一定關系。作為孢子最早、最直接與宿主接觸的部分，微孢子蟲表面蛋白在微孢子蟲侵染宿主的過程中起到重要作用。層粘連蛋白是重要的細胞外基質成分之一，在基膜的構建及細胞的粘附等方面都有重要的作用。本研究以微孢子蟲數據庫為依據，通過檢索相似物種的層粘連蛋白基因序列，發(fā)現家蠶微孢子蟲基因組存在層粘連蛋白基因的同源序列，以兩個假定的層粘連蛋白α、β亞基（NbHLAMA2、NbHLAMB4）為研究對象，克隆、分析了其序列特征，通過實

3、時熒光定量 PCR的方法分析了其轉錄活性，并進一步通過分子克隆、原核表達，制備了相應的多克隆抗體。利用免疫膠體金技術分析了NbHLAMA2在家蠶微孢子蟲中的亞細胞定位，體外宿主細胞粘附實驗和抗體封閉實驗研究了NbHLAMA2與孢子粘附宿主細胞的關系。通過酵母雙雜交系統，以NbHLAMB4作為誘餌蛋白，在家蠶中腸cDNA文庫中篩選到與NbHLAMB4相互作用的候選蛋白質。主要研究結果如下：
　　1. NbHLAMA2、NbHLAMB

4、4的克隆及序列分析
　　本研究成功地克隆了家蠶微孢子蟲假定層粘連蛋白基因 NbHLAMA2、NbHLAMB4，序列分析結果顯示：NbHLAMA2的開放閱讀框為1704bp，不具有內含子，該基因編碼的蛋白質含有568個氨基酸殘基，預測分子質量為67.80 kD，等電點為7.99；NbHLAMB4的開放閱讀框為1104bp，不具有內含子，該基因編碼的蛋白質含有367個氨基酸殘基，預測分子質量為43.74kD，等電點為5.72。NbHL

5、AMA2和NbHLAMB4編碼的蛋白質結構簡單，除了僅有一些糖基化位點之外，只含有一些卷曲螺旋和低復雜度基序，均無信號肽也無跨膜結構域。此外，NbHLAMA2與NbHLAMB4的氨基酸序列相似性為41％，E值為0.23。
　　2. NbHLAMA2、NbHLAMB4的轉錄特征分析
　　分別提取感染家蠶微孢子蟲后不同時期的家蠶中腸總 RNA并反轉錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉

6、錄情況。結果顯示，自感染家蠶微孢子蟲6h起便可以檢測到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉錄本，且之后各時期均可檢測到NbHLAMA2、NbHLAMB4基因的轉錄，這暗示了 NbHLAMA2、NbHLAMB4可能在家蠶微孢子蟲侵染及增殖過程中均發(fā)揮一定的作用。
　　3. NbHLAMA2、NbHLAMB4的原核表達及抗體制備
　　通過分子克隆技術，構建了重組原核表達載體 pET30a-NbHLAMA2和pET28a-N

7、bHLAMB4，并將之轉化E. coliBL21（DE3）進行融合蛋白誘導表達，獲得NbHLAMA2及NbHLAMB4重組蛋白。利用純化的蛋白免疫動物，制備了相應的多克隆抗體。
　　4. NbHLAMA2的定位分析及功能初探
　　通過免疫膠體金技術，對NbHLAMA2在家蠶微孢子蟲成熟孢子中的亞細胞定位進行研究，結果顯示NbHLAMA2主要定位在成熟孢子的孢子壁，同時在孢子內部也有分布。宿主細胞粘附實驗和抗體封閉實驗結果顯示

8、：NbHLAMA2蛋白能夠識別并結合到宿主細胞表面且抗體封閉后孢子粘附率下降，推測NbHLAMA2蛋白在孢子與宿主細胞的粘附過程中發(fā)揮一定作用。
　　5.應用酵母雙雜交技術篩選NbHLAMB4互作蛋白
　　應用酵母雙雜交技術，以NbHLAMB4作為誘餌蛋白，從家蠶中腸cDNA文庫中初步篩選得到了3個可能與NbHLAMB4相互作用的候選蛋白（熱休克蛋白、鋅指蛋白420類似物、氨肽酶N）。研究結果對理解NbHLAMB4在家蠶微孢