家蠶微孢子蟲LTR反轉座子的活性研究.pdf

1、微孢子蟲是一類專性細胞內(nèi)寄生的單細胞真核生物，能廣泛寄生于包括人在內(nèi)的所有動物，目前已報道的微孢子蟲有150個屬，1400多個種。作為最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲——家蠶微孢子蟲，能感染經(jīng)濟昆蟲家蠶引發(fā)家蠶微粒子病，攻克微粒子病一直是蠶業(yè)界的重點和難點。然而對于家蠶微孢子蟲研究基礎的薄弱，成為了攻克這一難關的瓶頸。 轉座子是基因組中可以從一個位點轉移至另一個位點并進而影響到與之相關的基因功能的遺傳因子，它廣泛分布于真菌、植物、昆蟲、魚類和

2、哺乳動物等，是基因組內(nèi)突變的主要原因之一。反轉座子是其中的一類，其在增殖和轉座時必須以RNA為中間產(chǎn)物，以DNA-RNA-DNA的方式進行。目前已經(jīng)在許多物種中發(fā)現(xiàn)了反轉座子，但是微孢子蟲相關的報道很少，本實驗室曾經(jīng)報道了8條完整的家蠶微孢子蟲LTR反轉座子—Nbr。本研究利用蛋白質組學的方法、RT-PCR法等，對于家蠶微孢子蟲中是否存在具有活性的反轉座子進行了探討，為進一步開展家蠶微孢子蟲的進化分析、基因功能的鑒定等奠定了基礎。

3、 1.蛋白質組學方法鑒定家蠶微孢子蟲的活性反轉座子 利用雙向電泳技術分離家蠶微孢子蟲總蛋白質，切膠獲得71個蛋白質點，經(jīng)過質譜分析鑒定出28個蛋白質，其中有4個注釋為Pol蛋白。Pol是它的一個ORF，編碼多聚蛋白。繼已報道的8個Nbr，將它們分別命名為Nbr5(為已報道的)、Nbr9、Nor10、Nbr11。這4個Pol蛋自分布在基因組不同的scaffold上，氨基酸長度分別為625aa、165aa、372aa、267aa，

4、分子量分別為34kD、19kD、49kD、31kD。通過在NCBI上BLASTP分析發(fā)現(xiàn)它們是反轉座子Pol ORF中的一段基因，編碼一種或幾種反轉座酶。 2.RT-PCK方法驗證家蠶微孢子蟲反轉座子的活性 由于MALDI-TOF-MS的方法不能獲得氨基酸序列，有一定的局限性，本研究進一步運用RT-PCR對該4個Pol多聚蛋白在家蠶微孢子蟲體內(nèi)的轉錄活性進行研究。采用感染家蠶微孢子蟲第10天的家蠶中腸提取RNA，并反轉錄

5、為sscDNA作為模板，結合Pol蛋白特異性引物做RT-PCR，擴增出了相應的目的條帶。通過RT-PCR進一步驗證了蛋白質組學方法獲得的4個Pol具有轉錄活性。 3.家蠶微孢子蟲EST庫中活性反轉座子的鑒定 從純化的家蠶微孢子蟲中提取總RNA，構建EST數(shù)據(jù)庫。在其中檢索到了3條注釋為pol多聚蛋白的EST序列，分別命名為Nbr12、Nbr13、Nbr14。BLASTP注釋的期望值都在5.00E-72以上、同源性大于87

6、％，EST長度大于300bp，檢索結果可信，表明這3個Pol多聚蛋白基因在家蠶微孢子蟲中具有轉錄本。 4.家蠶微孢子蟲活性反轉座子的生物信息學分析 將鑒定的7個具有轉錄活性的Pol多聚蛋白兩端延伸4000bp，結合生物信息學的方法，找出完整的LTR反轉座子。對其進行序列特征分析，發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲基因組內(nèi)LTR反轉座子的結構存在多樣性。LTR具有多態(tài)性，其長度為26～306bp不等。ORF也存在不完整的情況，Nbr11的頭

7、部序列缺失，不存在Gag和Pro結構域，RT結構域也不完整：Nbr10的Pro結構域缺失；Nbr9的RT結構域也是不完整的；而Nbrl2的RT結構域存在有1026bp的插入序列。雖然存在結構上的不完整，但一些保守基序仍然是存在的：Nbr10和Nbr13具有Cys基序(CX2CX4HX4C)，而Nbr12則有一個類似前者的基序(CX2HX4HX4C)：Nbr12、Nbr13、Nbr14的Pro結構域具有保守的D(T/S)G基序；而對于RT

8、結構域，7個反轉座子都存在YXDD基序：在它們的RH結構域中，除Nbr5和Nbr13具有的是類似DAS基序的DAC外，其他的反轉座子都存在該保守序列。 檢索發(fā)現(xiàn)7個LTR反轉座子的拷貝數(shù)都很低(1～10)；-而且拷貝間具有比較大的異質性(如Nbr14的Pi值為0.4280)，推測認為這些反轉座子進入家蠶微孢子蟲基因組的年代可能比較久遠，而且存在著丟失現(xiàn)象。當然，我們也發(fā)現(xiàn)除Nbr13外的其他家族都存在著同源性很高的拷貝(＞92％

9、)，認為近期轉座事件仍在發(fā)生著，也從另一方面支持了它們是具有活性的。而Nbr13只有一個拷貝，可能就是由于序列變異程度太大，不能被檢索出來。 這些LTR反轉座子與已經(jīng)報道的8個Nbr相似，具有Ty3/gypsy群的特征(INT結構域位于RT結構域的3’端)，也通過系統(tǒng)進化分析證明了這一分類，推測家蠶微孢子蟲基因組中的所有LTR反轉座子是來源于某一個Ty3/gypsy群的共同祖先。此外，進化樹也將14個Nbr分成了兩枝，活性未知N

10、br的一枝與真菌Ty3反轉座子聚為一簇，而另一枝是本文鑒定有活性的，它們與實蠅Yoyo反轉座子聚在一起。 以前研究認為Nbr對基因組的作用不大，它們多是與其他轉座元件成簇排列在一起，然后特異的插入共線性區(qū)域之間，不干擾基因組的正常排布。而我們除發(fā)現(xiàn)成簇聚集現(xiàn)象外(Nbr5)，還發(fā)現(xiàn)了插入共線性區(qū)域內(nèi)的Nbr11及其引起的基因組片段倒置現(xiàn)象，進一步分析發(fā)現(xiàn)它的Ka/Ks＞1，具有正向的進化壓力，推測認為它的轉座及引起的片段倒置適應

11、了基因組的要求而被接受了下來。由此說明，家蠶微孢予蟲中的反轉座子對在基因組重排、進化起到積極的作用。 結論：通過蛋白質組學方法鑒定、RT-PCR驗證、EST庫搜索，在家蠶微孢子蟲中共發(fā)現(xiàn)了7個具有活性的Pol多聚蛋白，利用生物信息學分析確定它們都是完整LTR反轉座子的一部分，從而推斷這些反轉座子也是具有活性的。然后對這些反轉座子進行相關生物信息分析，發(fā)現(xiàn)它們與之前已經(jīng)報道的Nbr屬于同一群體，拷貝數(shù)不高，各家族成員間卻有較大的異