柞蠶微孢子蟲核糖體基因及家蠶、柞蠶微孢子蟲蛋白質(zhì)組以及侵染家蠶后中腸的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、微孢子蟲是一種專營細胞內(nèi)寄生的單細胞生物，能感染從原生動物到哺乳動物，包括昆蟲，魚類和人類在內(nèi)的幾乎所有的動物。家蠶、柞蠶微孢子蟲是引起家蠶和柞蠶微粒子病的病原，微粒子病對養(yǎng)蠶業(yè)來說是一種毀滅性的病害。我國每年因為微粒子病燒掉的蠶種價值上億元，特別是近兩年微粒子病在中國蠶業(yè)生產(chǎn)上又有回頭的趨勢。因此，對微孢子蟲的研究既具有理論意義，也具有經(jīng)濟價值。 本研究以家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲為實驗材料，克隆測序了柞蠶微孢子蟲的核糖體基因

2、，為柞蠶微孢子蟲的分類和系統(tǒng)進化分析提供分子生物學(xué)的依據(jù)，也從分子水平上分析了家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲的進化關(guān)系。結(jié)合二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)分離、鑒定了家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲的總蛋白，在整體水平上分析了微孢子蟲的蛋白質(zhì)組成。用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較了家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲接種五齡家蠶后不同時間段家蠶中腸的蛋白質(zhì)變化，分析了家蠶中腸對微孢子蟲的應(yīng)答模式，從蛋白質(zhì)組的水平上篩選與感染相關(guān)的特異性蛋白標(biāo)志物和抗性功能相關(guān)的蛋白。

3、 一、柞蠶微孢子蟲的核糖體基因 用特異引物進行PCR擴增，克隆和測序了柞蠶微孢子蟲的核糖體基因，得到柞蠶微孢子蟲LSU rRNA基因的部分序列， SSU rRNA，5S rRNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSl和ITS2)的全序列(Genbank登錄號為DQ073396)。柞蠶微孢子蟲的核糖體基因排列順序為LSU-ITS-SSU-ITS-5S，和家蠶微孢子蟲的排列順序相同，是一種即不同于真核生物，也不同于原核生物的排列順序。用SSU r

4、RNA和ITS序列進行同源比對和進化分析，柞蠶微孢子蟲屬于Nosema屬，是和家蠶微孢子蟲進化關(guān)系很近的一個種。本研究為柞蠶微孢子蟲的分類提供了分子生物學(xué)的證據(jù)，將微孢子SSU rRNA基因和ITS結(jié)合起來分析微孢子蟲的親緣關(guān)系是一個很好的嘗試。 二、家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了微孢子蟲的蛋白質(zhì)組。純化的微孢子經(jīng)液氮研磨和超聲波破碎，用蛋白抽提液抽提微孢子總蛋白，然后二維電泳，質(zhì)譜

5、鑒定。家蠶微孢子蟲鑒定到16個蛋白，其中有4種酶，2種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，2種膜通道蛋白，1種細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，1種信號分子相關(guān)的蛋白，1種核糖體蛋白和5種功能未知蛋白。柞蠶微孢子蟲鑒定到9個蛋白，其中有3種酶，3種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，1種外膜糖蛋白，1種鈣離子相關(guān)的膜通道蛋白和1種熱激蛋白。結(jié)合生物信息學(xué)和文獻檢索的方法，初步分析了這些蛋白的功能。在家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲鑒定的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和膜蛋白占了較大的比例，說明酶、轉(zhuǎn)錄

6、調(diào)控因子和膜蛋白確實是微孢子蟲孢子時期大量表達和存在的蛋白質(zhì)，這也與孢子的結(jié)構(gòu)和生理吻合。 三、家蠶微孢子蟲，柞蠶微孢子蟲和清水接種家蠶后家蠶中腸的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 取接種家蠶微孢子蟲，柞蠶微孢子蟲和清水對照處理后的24h，48h，72h家蠶(品種：C108)中腸總蛋白，進行二維電泳和質(zhì)譜鑒定。用比較蛋白質(zhì)組的方法對接種不同微孢子蟲后不同時間段的中腸蛋白質(zhì)的變化和家蠶中腸對微孢子的應(yīng)答機制進行了研究?？偟膩碚f，許多酶類

7、表現(xiàn)出表達量的差異，在取材的三個時間段中，大部分參與碳水化合物代謝的酶在接種家蠶微孢子蟲的家蠶中腸中呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，如烯醇酶和羥基丙酮酸異構(gòu)酶；而參與蛋白質(zhì)和氨基酸降解的酶類卻呈上調(diào)的趨勢，如蛋白酶和延胡索酰乙酰水解酶。在接種家蠶微孢子蟲的家蠶中腸的H+通道V-ATPase比接種柞蠶微孢子蟲和清水的有減少的趨勢。有趣的是參與免疫和應(yīng)答反應(yīng)的一些蛋白，接種家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲24h后的家蠶中腸中的表達量都比對照高，在72h后，接種家

8、蠶微孢子蟲的表達量比接種柞蠶微孢子蟲和對照的低。這個結(jié)果和PD-QtJEST軟件分析的二維電泳圖譜的結(jié)果一致。 肌動蛋白解聚合因子4，硫氧化/還原蛋白過氧化物酶和抗胰糜蛋白酶前體是差異蛋白中最值得研究和重視的蛋白。 肌動蛋白解聚合因子是一種在真核生物中廣泛存在的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在調(diào)控細胞內(nèi)肌動蛋白纖絲的解聚合和再聚合中起著關(guān)鍵作用。在接種微孢子實驗中，肌動蛋白解聚合因子4表現(xiàn)出明顯的差別，在接種了家蠶微孢子蟲24h和7

9、2h時的家蠶中腸的二維電泳銀染圖中沒有肌動蛋白解聚合因子4，而接種柞蠶微孢子蟲和對照中卻有該蛋白明顯的染色。說明感染了家蠶微孢子蟲的中腸細胞的肌動蛋白纖絲的解聚合和再聚合平衡被打破，中腸細胞的細胞骨架遭到破壞。肌動蛋白纖絲的解聚合和再聚合平衡被打破是家蠶微孢子蟲在家蠶中腸細胞中生長發(fā)育的前提還是微孢子蟲感染后的病理反應(yīng)還需進一步的研究。肌動蛋白解聚合因子4有可能成為治療和鑒定家蠶感染微孢子蟲的目標(biāo)蛋白。 硫氧化/還原蛋白過氧化物

10、酶是一種抗氧化酶系，在生物體對活性氧族的防御系統(tǒng)中和在宿主與寄生蟲之間的相互影響中起著主要作用。硫氧化/還原蛋白過氧化物酶在取材的24h，48h和72h都被鑒定出表達量上的差異。接種家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲24h時后，該蛋白在家蠶中腸中表達量都比對照高，48h時后，接種家蠶微孢子蟲比接種柞蠶微孢子蟲的表達量高，72h時后接種家蠶微孢子蟲比接種柞蠶微孢子蟲以及對照表達量低。說明硫氧化/還原蛋白過氧化物酶參與了家蠶中腸對微孢子蟲的免疫應(yīng)答

11、。 抗胰糜蛋白酶前體是抗胰糜蛋白酶因子的前體形式，沒有活性，經(jīng)加工后才能形成具有活性的抗胰糜蛋白酶因子?？挂让拥鞍酌敢蜃?antichymotrypsin)屬于抑絲酶家族(serpins)，參與蛋白質(zhì)的加工、細胞凋亡、細胞外基質(zhì)重構(gòu)、以及保護細胞免受損傷等。人類細胞質(zhì)中的抗胰糜蛋白酶因子的升高是燒死，外傷和一些癌癥急性期的標(biāo)志物?？挂让拥鞍酌盖绑w在接種家蠶微孢子蟲72h后，家蠶中腸中的表達量遠遠高于在接種柞蠶微孢子蟲以及對照的表