家蠶羽化變態(tài)時(shí)期血液蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目的模式昆蟲(chóng)。家蠶的血液承擔(dān)著許多重要的生理機(jī)能，是內(nèi)環(huán)境中重要的組成部分，通過(guò)消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和體內(nèi)分泌的激素等，大多通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)礁鹘M織細(xì)胞中，維持蠶體的基礎(chǔ)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。家蠶血液是中間代謝的場(chǎng)所，其蛋白質(zhì)的變化將有效揭示家蠶生理和病理的變化機(jī)制。在羽化這一變態(tài)的重要時(shí)期，其生理結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，而這些變化是靠血液中一些重要的蛋白來(lái)參與完成的。蠶蛾不攝取食物，蠶蛾的運(yùn)動(dòng)和交配都需要儲(chǔ)藏蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)提供能量和輸送

2、能量，而且許多成蟲(chóng)特有的生物學(xué)行為的調(diào)控也要靠血液中的小分子蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。家蠶血液蛋白質(zhì)組研究處于剛起步階段，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)報(bào)道不多。本研究在實(shí)驗(yàn)室對(duì)家蠶蛋白質(zhì)組的研究基礎(chǔ)上，利用雙向電泳和質(zhì)譜手段，鑒定出了血液中一些與羽化相關(guān)的重要蛋白。利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)手段通過(guò)圖象掃描和計(jì)算機(jī)軟件分析找出了羽化前后雙向電泳圖譜的差異蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行鑒定，然后采用生物信息學(xué)的手段和核酸水平上的研究再對(duì)蛾期高表達(dá)的Apolipoph

3、orin Ⅲ蛋白的功能進(jìn)行了初步研究。主要包括以下內(nèi)容： 1．家蠶羽化前后血液蛋白的雙向電泳及質(zhì)譜鑒定：利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建了本實(shí)驗(yàn)室家蠶羽化前后血液雙向電泳圖譜庫(kù)，這些圖譜中的蛋白主要分布在分子量15～90KD，等電點(diǎn)3.5～9.5之間。利用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定了羽化前后50個(gè)分離明顯的蛋白點(diǎn)，其中的38個(gè)蛋白點(diǎn)得到了良好的鑒定結(jié)果。在成功鑒定的38個(gè)蛋白點(diǎn)里面，其中包括五種蛋白抑制劑：CI-8A、CI-2、antichymot

4、rypsin precursor、antitrypsin precursor、inhibitor of apoptosis 1，三種與代謝途徑相關(guān)的酶：beta-N-acetylglucosaminidase isoform A、aminoacylase、hydroxypyruvateisomerase，兩種與免疫相關(guān)的酶：Phenoloxidase subunit 1、hemolin，兩種分子伴侶：peptidylprolylisom

5、erase B、heat shock protein hsp20．1，兩種與生物學(xué)行為調(diào)控相關(guān)的蛋白：diapause bioclockprotein、dehydroecdysone3-reductase，一種儲(chǔ)藏蛋白：Vg，三種小分子量脂蛋白：ApolipophorinD、Apolipophorin Ⅲ、30k protien。其中dehydroecdysone3-reductase和ApolipophorinD在家蠶中是新發(fā)現(xiàn)的蛋白

6、質(zhì)，并未有過(guò)報(bào)道。這也預(yù)示著血液作為家蠶重要的內(nèi)環(huán)境體系，其中的蛋白質(zhì)在羽化時(shí)參與了許多復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。 2．家蠶羽化前后差異蛋白的比較分析：用Image Master2D Platinum分析軟件對(duì)蛹6天和羽化當(dāng)天的血液雙向電泳圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配，在蛹6天的201個(gè)點(diǎn)和羽化當(dāng)天的156個(gè)點(diǎn)中有97個(gè)點(diǎn)匹配上了，匹配率為54.3417％，同時(shí)也說(shuō)明了相互之間存在著許多差異點(diǎn)。從蛹6天與羽化當(dāng)天血液的雙向電泳圖譜中，我們找到了6個(gè)差異明

7、顯的區(qū)域，分別是蛋白酶抑制劑CI-8，蛹期比蛾期表達(dá)量高；卵黃原蛋白，蛹期比蛾期表達(dá)量高：30K蛋白，蛹期表達(dá)量比蛾期高；ApolipophorinD蛋白，它在蛾期并不表達(dá)：diapause bioclock protein，它在蛾期也不表達(dá)；Apolipophorin Ⅲ蛋白，它是蛾期高表達(dá)的一個(gè)蛋白。這些差異的蛋白點(diǎn)有可能揭示羽化這一變態(tài)重要時(shí)期復(fù)雜的生理反應(yīng)。 3．Apolipophorin Ⅲ基因的克隆及功能初步分析：根

8、據(jù)質(zhì)譜鑒定所得的蛋白質(zhì)序列有186個(gè)氨基酸殘基，翻譯成cDNA序列，長(zhǎng)為623bp，ORF長(zhǎng)為560bp，與家蠶基因組序列比對(duì)顯示Apolipophorin Ⅲ基因總長(zhǎng)為1076 bp，有四個(gè)外顯子，三個(gè)內(nèi)含子。并成功克隆出ApolipophorinⅢ基因的基因組全長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)了質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因在鱗翅目中的同源性較高，其中與天蛾科的同源性最高，而在直翅目中同源性較低。因此，ApolipophorinⅢ基因在進(jìn)化

9、過(guò)程中，鱗翅目之間的進(jìn)化相對(duì)比其它目要保守。 SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，Apolipophorin Ⅲ蛋白在化蛾前的表達(dá)量急劇上升，說(shuō)明Apolipophorin Ⅲ蛋白極有可能是參與了蛾期的脂質(zhì)物質(zhì)運(yùn)輸，而且還起著極其重要的作用。從芯片結(jié)果分析，羽化前Apolipophorin Ⅲ基因表達(dá)量雄高于雌，極有可能是雄蛾的飛行能力比雌蛾強(qiáng)。 RT-PCR檢測(cè)表明，Apolipophorin Ⅲ基因在很多組織中都有表達(dá)，所