家蠶羽化變態(tài)時期血液蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目的模式昆蟲。家蠶的血液承擔著許多重要的生理機能，是內(nèi)環(huán)境中重要的組成部分，通過消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)和體內(nèi)分泌的激素等，大多通過血液運輸?shù)礁鹘M織細胞中，維持蠶體的基礎代謝和生長發(fā)育。家蠶血液是中間代謝的場所，其蛋白質(zhì)的變化將有效揭示家蠶生理和病理的變化機制。在羽化這一變態(tài)的重要時期，其生理結構發(fā)生了巨大的變化，而這些變化是靠血液中一些重要的蛋白來參與完成的。蠶蛾不攝取食物，蠶蛾的運動和交配都需要儲藏蛋白和轉運蛋白來提供能量和輸送

2、能量，而且許多成蟲特有的生物學行為的調(diào)控也要靠血液中的小分子蛋白來實現(xiàn)。家蠶血液蛋白質(zhì)組研究處于剛起步階段，目前國內(nèi)外有關報道不多。本研究在實驗室對家蠶蛋白質(zhì)組的研究基礎上，利用雙向電泳和質(zhì)譜手段，鑒定出了血液中一些與羽化相關的重要蛋白。利用比較蛋白質(zhì)組學手段通過圖象掃描和計算機軟件分析找出了羽化前后雙向電泳圖譜的差異蛋白，并利用質(zhì)譜技術對這些差異蛋白進行鑒定，然后采用生物信息學的手段和核酸水平上的研究再對蛾期高表達的Apolipoph

3、orin Ⅲ蛋白的功能進行了初步研究。主要包括以下內(nèi)容： 1．家蠶羽化前后血液蛋白的雙向電泳及質(zhì)譜鑒定：利用雙向電泳技術構建了本實驗室家蠶羽化前后血液雙向電泳圖譜庫，這些圖譜中的蛋白主要分布在分子量15～90KD，等電點3.5～9.5之間。利用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定了羽化前后50個分離明顯的蛋白點，其中的38個蛋白點得到了良好的鑒定結果。在成功鑒定的38個蛋白點里面，其中包括五種蛋白抑制劑：CI-8A、CI-2、antichymot

4、rypsin precursor、antitrypsin precursor、inhibitor of apoptosis 1，三種與代謝途徑相關的酶：beta-N-acetylglucosaminidase isoform A、aminoacylase、hydroxypyruvateisomerase，兩種與免疫相關的酶：Phenoloxidase subunit 1、hemolin，兩種分子伴侶：peptidylprolylisom

5、erase B、heat shock protein hsp20．1，兩種與生物學行為調(diào)控相關的蛋白：diapause bioclockprotein、dehydroecdysone3-reductase，一種儲藏蛋白：Vg，三種小分子量脂蛋白：ApolipophorinD、Apolipophorin Ⅲ、30k protien。其中dehydroecdysone3-reductase和ApolipophorinD在家蠶中是新發(fā)現(xiàn)的蛋白

6、質(zhì)，并未有過報道。這也預示著血液作為家蠶重要的內(nèi)環(huán)境體系，其中的蛋白質(zhì)在羽化時參與了許多復雜的生物學過程。 2．家蠶羽化前后差異蛋白的比較分析：用Image Master2D Platinum分析軟件對蛹6天和羽化當天的血液雙向電泳圖譜進行蛋白點匹配，在蛹6天的201個點和羽化當天的156個點中有97個點匹配上了，匹配率為54.3417％，同時也說明了相互之間存在著許多差異點。從蛹6天與羽化當天血液的雙向電泳圖譜中，我們找到了6個差異明

7、顯的區(qū)域，分別是蛋白酶抑制劑CI-8，蛹期比蛾期表達量高；卵黃原蛋白，蛹期比蛾期表達量高：30K蛋白，蛹期表達量比蛾期高；ApolipophorinD蛋白，它在蛾期并不表達：diapause bioclock protein，它在蛾期也不表達；Apolipophorin Ⅲ蛋白，它是蛾期高表達的一個蛋白。這些差異的蛋白點有可能揭示羽化這一變態(tài)重要時期復雜的生理反應。 3．Apolipophorin Ⅲ基因的克隆及功能初步分析：根

8、據(jù)質(zhì)譜鑒定所得的蛋白質(zhì)序列有186個氨基酸殘基，翻譯成cDNA序列，長為623bp，ORF長為560bp，與家蠶基因組序列比對顯示Apolipophorin Ⅲ基因總長為1076 bp，有四個外顯子，三個內(nèi)含子。并成功克隆出ApolipophorinⅢ基因的基因組全長，進一步證實了質(zhì)譜鑒定的準確性。同源性比對發(fā)現(xiàn)，該基因在鱗翅目中的同源性較高，其中與天蛾科的同源性最高，而在直翅目中同源性較低。因此，ApolipophorinⅢ基因在進化

9、過程中，鱗翅目之間的進化相對比其它目要保守。 SDS-PAGE電泳檢測表明，Apolipophorin Ⅲ蛋白在化蛾前的表達量急劇上升，說明Apolipophorin Ⅲ蛋白極有可能是參與了蛾期的脂質(zhì)物質(zhì)運輸，而且還起著極其重要的作用。從芯片結果分析，羽化前Apolipophorin Ⅲ基因表達量雄高于雌，極有可能是雄蛾的飛行能力比雌蛾強。 RT-PCR檢測表明，Apolipophorin Ⅲ基因在很多組織中都有表達，所