奶牛源隱孢子蟲的鑒定及隱孢子蟲囊壁蛋白基因的克隆.pdf

1、隱孢子蟲病(Cryptosporidisis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidium)感染引起的一種全球性人畜共患寄生蟲病。隱孢子蟲是人和動(dòng)物腹瀉的重要病原之一，也是人類艾滋病患者的主要致死因素之一。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲病進(jìn)行了較廣泛而深入的研究，但合肥地區(qū)隱孢子蟲種類尚不清楚。
　　 本課題旨在通過對(duì)合肥地區(qū)某奶牛場(chǎng)奶牛糞樣中隱孢子蟲的檢查，獲取隱孢子蟲感染陽(yáng)性奶牛，從陽(yáng)性奶牛糞樣中分離出隱孢子蟲卵囊，采用形態(tài)學(xué)

2、和分子生物學(xué)方法進(jìn)行隱孢子蟲蟲種鑒定，為隱孢子蟲病的防治提供理論依據(jù)；提取隱孢子蟲卵囊的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得隱孢子蟲cDNA，擴(kuò)增隱孢子蟲囊壁蛋白基因，以期為篩選研制隱孢子蟲疫苗的抗原候選分子提供資料。
　　 首先采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對(duì)合肥地區(qū)某奶牛場(chǎng)285頭成年母牛糞樣進(jìn)行隱孢子蟲卵囊檢測(cè)，飽和蔗糖溶液漂浮法檢出隱孢子蟲陽(yáng)性奶牛5頭，其感染率為1.8％；改良抗酸染色法檢出隱孢子蟲陽(yáng)性奶牛6頭，感染率為2.

3、1％。根據(jù)隱孢子蟲卵囊的形態(tài)、大小和卵形指數(shù)(長(zhǎng)/寬)等特征對(duì)所獲蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，飽和蔗糖溶液漂浮法檢獲的卵囊為橢圓形或卵圓形，大小平均為7.37μm×6.13μm，卵形指數(shù)為1.20；改良抗酸染色法檢獲的卵囊為橢圓形或卵圓形，呈玫瑰紅色，周圍深染，中央淡染，大小平均為7.58μm×6.20μm，卵形指數(shù)為1.22，初步鑒定飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢出的隱孢子蟲均為安氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumanderso

4、ni)。
　　 其次采集飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)均為隱孢子蟲陽(yáng)性的5頭奶牛糞樣，分離隱孢子蟲卵囊。根據(jù)隱孢子蟲18SrRNA基因和HSP70基因序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)PCR反應(yīng)引物和2對(duì)巢式PCR反應(yīng)引物，以所獲卵囊基因組為模板分別進(jìn)行PCR反應(yīng)和巢式PCR反應(yīng)，對(duì)巢式PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與隱孢子蟲有效蟲種的18SrRNA基因和HSP70基因序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建，從而確定所獲隱孢子

5、蟲的種類。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出的隱孢子蟲18SrRNA基因和HSP70基因片段分別為540bp和448bp，巢式PCR擴(kuò)增出的隱孢子蟲18SrRNA基因和HSP70基因片段分別為250bp和325bp(GenBank登錄號(hào)分別為JQ031803、JQ031804.、JQ031805、JQ031806、JQ031807、JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ031811、JQ031812)，與預(yù)期片段大小基本一致；將巢

6、式PCR產(chǎn)物序列與隱孢子蟲相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，這5株分離株18srRNA基因與安氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumandersoni)DQ989573序列一致性最高，兩者在系統(tǒng)進(jìn)化樹上為同一分支；這5株分離株的HSP70基因片段與安氏隱孢子蟲AY954892和DQ989576序列一致性最高，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上為同一分支，因此確定所分離的5株奶牛源隱孢子蟲分離株均為安氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumanderson

7、i)。
　　 最后采集安氏隱孢子蟲陽(yáng)性奶牛的新鮮糞樣，提取隱孢子蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以單鏈cDNA為模板擴(kuò)增出安氏隱孢子蟲囊壁蛋白基因部分片段，并進(jìn)行克隆、測(cè)序，將測(cè)序所得序列與GeneBank已發(fā)布的隱孢子蟲囊壁蛋白基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，從而確定隱孢子蟲囊壁蛋白基因的突變情況。通過反轉(zhuǎn)錄和PCR方法擴(kuò)增出安氏隱孢子蟲囊壁蛋白基因499bp片段，經(jīng)克隆、測(cè)序及序列分析，此次擴(kuò)增出的COWP序列與登陸號(hào)為DQ98957