隱孢子蟲蟲種鑒定及安氏隱孢子蟲體外培養(yǎng)研究.pdf

1、目的： 隱孢子蟲是引起人類腹瀉的重要病原體，嚴(yán)重威脅嬰幼兒及免疫功能缺陷患者生命，尚無有效地治療方法，開展隱孢子蟲診斷技術(shù)和治療藥物研究對于防治隱孢子蟲病具有重要意義。本研究建立PCR—RFLP技術(shù)和基因測序技術(shù)用于鑒定隱孢子蟲蟲種；建立經(jīng)濟(jì)高效的隱孢子蟲卵囊基因組DNA純化方法用于PCR檢測；建立安氏隱孢子蟲細(xì)胞模型，用于抗隱孢子蟲藥物的篩選。 方法： 根據(jù)隱孢子蟲SSUrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，Nest—PC

2、R技術(shù)擴(kuò)增來源于牛、小鼠和大鼠的3株隱孢子蟲SSUrRNA序列，RFLP技術(shù)和基因測序技術(shù)鑒定蟲種。 在隱孢子蟲卵囊懸液中分別加入進(jìn)口試劑盒和國產(chǎn)試劑盒的裂解液以及2％TritonX-100和5％異硫氰酸胍，輔以不同組合方式使用的凍融法、蛋白酶K法和聲裂法裂解卵囊，通過Real—timePCR法測定裂解產(chǎn)物中隱孢子蟲卵囊囊壁蛋白(COWP)基因拷貝數(shù)。 安氏隱孢子蟲卵囊感染人結(jié)腸癌(HCT-8)細(xì)胞，Real—timeP

3、CR技術(shù)測定RPMI-1640培養(yǎng)液中分別加入不同濃度胎牛血清、葡萄糖、維生素C、葉酸、泛酸鈣和胰島素后蟲體的增殖效果。Giemsa染色觀察蟲體的增殖，透射電鏡觀察蟲體發(fā)育形態(tài)。 MTT法測定硝唑尼特和銀杏酸對HCT-8細(xì)胞安全濃度。Real—timePCR技術(shù)測定不同濃度NTZ和Gas作用后COWP基因拷貝數(shù)，透射電鏡觀察NTZ和Gas對蟲體生長的影響。 結(jié)果： PCR—RFLP技術(shù)與基因測序技術(shù)鑒定牛源、小鼠

4、源和大鼠源隱孢子蟲分別為安氏隱孢子蟲、隱孢蟲小鼠型和隱孢子蟲大鼠型。 進(jìn)口試劑盒的裂解液裂解隱孢子蟲卵囊效果最好，純化所得卵囊COWP基因拷貝數(shù)可達(dá)(6.450～9.861)×106個(gè)；其次為國產(chǎn)試劑盒的裂解液，卵囊COWP基因拷貝數(shù)(2.377～3.689)×106個(gè)；再次為5％異硫氰酸胍，COWP基因拷貝數(shù)為(1.272～21.29)×105個(gè)；而2％TritonX-100的裂解效果最差，COWP基因拷貝數(shù)僅為(2.060～

5、866.7)×103個(gè)。凍融法+蛋白酶K法+聲裂法提純隱孢子蟲卵囊DNA效果最佳，其次為凍融法+聲裂法和蛋白酶K法+聲裂法，凍融法+蛋白酶K法效果最差。 10％FCS是培養(yǎng)安氏隱孢子蟲的最佳FCS濃度，葡萄糖、維生素C和胰島素都具有促安氏隱孢子蟲增殖作用，泛酸鈣無促蟲體增殖效果，而葉酸則抑制蟲體增殖。10％FCSRPMI-1640培養(yǎng)液中加入50mmol/L葡萄糖，50μg/ml維生素C和0.3U/ml胰島素促安氏隱孢子蟲增殖效

6、果最顯著，蟲體增殖8倍。Giemsa染色也支持上述結(jié)果。透射電鏡在HCT-8細(xì)胞中觀察到安氏隱孢子蟲的滋養(yǎng)體、雌配子體、雄配子體、Ⅰ型裂殖體、Ⅱ型裂殖體和子孢子階段。 1.25μg/mlNTZ和0.31μg/mlGAs即可顯著抑制HCT-8細(xì)胞中安氏隱孢子蟲的增殖。20μg/mlNTZ和5μg/mlGAs作用后，蟲體數(shù)量僅分別為未加藥的0.29％和0.66％。透射電鏡觀察，未加藥組多數(shù)細(xì)胞被蟲體破壞，而NTZ和Gas組蟲體結(jié)構(gòu)萎

7、縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本保持正常。 結(jié)論： PCR—RFLP技術(shù)和基因測序技術(shù)均可用于鑒定隱孢子蟲蟲種，RFLP技術(shù)適用于臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查，基因測序技術(shù)可用于鑒定新種。 凍融法+蛋白酶K法+聲裂法聯(lián)合使用能使卵囊DNA的提純效率達(dá)到最大，國產(chǎn)基因組DNA純化試劑盒和5％異硫氰酸胍裂解法提純隱孢子蟲卵囊DNA可獲得與進(jìn)口試劑盒相近的效果。 安氏隱孢子蟲可在HCT-8細(xì)胞內(nèi)增殖，培養(yǎng)液中不同添加物對安氏隱孢子蟲