安氏隱孢子蟲體外發(fā)育形態(tài)觀察及其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)是一種主要寄生于胃腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的原蟲,是引起人類腹瀉的重要病原體之一。安氏隱孢子蟲(Cryptosporidium andersoni)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可感染人類的隱孢子蟲,作為一種潛在的病原,它不僅與微小隱孢子蟲寄生部位不同,而且在同樣的條件下生長(zhǎng)和增殖的速度也較微小隱孢子蟲快。因而,開展安氏隱孢子蟲生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究對(duì)隱孢子蟲病治療具有重要意義。本研究通

2、過Giemsa染色法和real—time PCR技術(shù)檢測(cè)安氏隱孢子蟲在人結(jié)腸腺癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)細(xì)胞和人胃腺癌(human stomach adenocarcinoma,AGS)細(xì)胞中的增殖效果,以建立安氏隱孢子蟲適宜的宿主；通過Giemsa染色法、HE染色法和改良抗酸染色法觀察安氏隱孢子蟲在細(xì)胞中的生長(zhǎng)發(fā)育,并比較三種染色技術(shù)對(duì)蟲體不同發(fā)育時(shí)期的鑒別效果,為隱孢子蟲生長(zhǎng)發(fā)育的

3、研究提供一種簡(jiǎn)便、易行的方法；通過Hoechst33258染色法和Annexin V-FITC／PI雙染,觀察安氏隱孢子蟲對(duì)宿主細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞凋亡率的影響；建立半定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定安氏隱孢子蟲感染不同時(shí)間Caspase3和Bcl-2基因的表達(dá)水平,初步研究安氏隱孢子蟲對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8細(xì)胞和AGS細(xì)胞,接種于6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60％～70％時(shí),加入2.5×10

4、5個(gè)安氏隱孢子蟲卵囊,培養(yǎng)至24 h和48 h,以Giemsa染色法和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)蟲體在細(xì)胞中的增殖；取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8細(xì)胞,接種于6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60％～70％時(shí),加入2.5×105個(gè)安氏隱孢子蟲卵囊,培養(yǎng)至5 h、24 h、48 h、72 h和96 h,經(jīng)Giemsa、HE和改良抗酸染色觀察蟲體的生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)。安氏隱孢子蟲卵囊感染HCT-8細(xì)胞后,經(jīng)Hoechst33258染色法檢測(cè)凋

5、亡細(xì)胞；經(jīng)Annexin V-FITC／PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；半定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定感染后5 h、12 h、24 h、48 h和72 h,Caspase3和Bcl-2基因的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：經(jīng)Giemsa染色檢測(cè)感染24 h,HCT-8和AGS細(xì)胞中蟲體數(shù)量分別為97.670±5.686和85.670±3.786；培養(yǎng)至48 h,HCT-8和AGS細(xì)胞中蟲體數(shù)量分別為144.000±19.975和95.3

6、33±20.526。Real—time PCR法測(cè)得24 h HCT-8和AGS細(xì)胞中卵囊COWP基因拷貝數(shù)分別為469.000±107.531和275.333±40.054；48 h HCT-8和AGS細(xì)胞中卵囊COWP基因拷貝數(shù)分別為664.000±112.708和360.333±67.144。安氏隱孢子蟲卵囊感染HCT-8細(xì)胞后,經(jīng)改良抗酸染色后可清楚地觀察到子孢子、滋養(yǎng)體、裂殖體、雌配子體、雄配子體、合子和卵囊,而經(jīng)Giemsa

7、和HE染色后僅隱約鑒別出子孢子、滋養(yǎng)體、雌配子體、合子和卵囊,未觀察到裂殖體和雄配子體。安氏隱孢子蟲卵囊感染HCT-8細(xì)胞24 h和48 h,經(jīng)Hoechst33258染色法可觀察到凋亡細(xì)胞；經(jīng)Annexin V-FITC／PI雙染流式細(xì)胞儀分析感染24 h,對(duì)照組與感染組細(xì)胞凋亡率分別為7.41±0.56％和8.36±0.33％；感染48 h,感染組絀胞凋亡率為12.85±0.24％、對(duì)照組為10.76±0.36％；經(jīng)半定量RT-PC

8、R技術(shù)測(cè)得安氏隱孢子蟲感染5,12,48和72 h Caspase3mRNA表達(dá)量明顯增加；而Bcl-2 mRNA的表達(dá)量未見明顯差異。
　　 結(jié)論：與AGS細(xì)胞相比,以HCT-8細(xì)胞作為體外感染模型更利于安氏隱孢子蟲的增殖。改良抗酸染色法較Giemsa和HE染色法更省時(shí)、效果更佳,此法易于分辨細(xì)胞和蟲體,并可清晰辨別蟲體發(fā)育的不同階段。安氏隱孢子蟲感染可致細(xì)胞凋亡,Caspase3基因參與了安氏隱孢子蟲介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但Bcl