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文檔簡介
1、哺乳動物的生殖細胞發(fā)育是非常復(fù)雜的過程,受到多種激素、生長因子以及外源營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控。植物性生物活性物質(zhì)人參皂甙(ginsenosides,GS)和大豆黃酮(daidzein,DAI)具有多種生物學(xué)功能,如抗氧化作用、雌激素樣作用以及提高繁殖性能等,因而成為當(dāng)前相關(guān)研究和開發(fā)的熱點之一。然而,GS和DAI對生殖細胞發(fā)育的作用尚不清楚。因此,本實驗以體外培養(yǎng)的小鼠A型精原細胞和卵母細胞為實驗?zāi)P?研究GS和DAI對A型精原細胞增殖和卵母細
2、胞減數(shù)分裂成熟的作用并探討其機理,為植物性生物活性物質(zhì)對哺乳動物生殖細胞發(fā)育的營養(yǎng)調(diào)控作用提供理論指導(dǎo)。
1.小鼠A型精原細胞增殖的激素調(diào)控
出生6天的ICR小鼠的睪丸組織用膠原酶分散成單個細胞,建立精原細胞-體細胞體外無血清共培養(yǎng)系統(tǒng)。經(jīng)c-kit免疫細胞化學(xué)鑒定表明所分離和培養(yǎng)的生殖細胞為A型精原細胞。增殖細胞核抗原免疫組織化學(xué)檢測表明添加了10μg/ml胰島素、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8 mol
3、/L亞硒酸鈉的DMEM培養(yǎng)液(ITS培養(yǎng)液)可維持A型精原細胞的存活和增殖。本實驗利用所建立的培養(yǎng)模型研究了卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、睪酮(testosterone,T)和雌二醇(17β-estradiol,E2)對小鼠A型精原細胞增殖的影響,從而驗證該培養(yǎng)模型在外源因素對生殖細胞發(fā)育影響研究上的適用性。EGF及
4、其受體(EGFR)免疫細胞化學(xué)結(jié)果表明EGF和EGFR主要表達于精原細胞。單獨的FSH(1~100 ng/ml)或EGF(1~10 ng/ml)顯著促進精原細胞的增殖。FSH(10 ng/ml)聯(lián)合EGF(0.1 ng/ml)具有加性效應(yīng),但與更高劑量的EGF(1~10 ng/ml)聯(lián)合處理則降低了FSFI的刺激作用。此外,T(10-3~10-6 mol/L)和E2(10-8~10-6 mol/L)均能促進小鼠A型精原細胞體外增殖,雄激
5、素受體阻斷劑氟硝丁酰胺(flutamide.FLU)或雌激素受體阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen,TMX)可分別抑制T或E2的促增殖作用,這說明T和E2是通過體細胞的介導(dǎo)而發(fā)揮其促進精原細胞增殖的作用。以上結(jié)果表明生殖細胞-體細胞共培養(yǎng)模型中的精原細胞對促性腺激素和性激素以及生長因子具有較好的反應(yīng)性,FSH和T及E2可通過共培養(yǎng)模型中的體細胞分泌的旁分泌因子間接作用于生殖細胞,EGF直接作用于生殖細胞,從而促進精原細胞的增殖。這說明本
6、實驗建立的培養(yǎng)模型是一種評價A型精原細胞體外增殖調(diào)控的合適模型,并可用于哺乳動物精原細胞發(fā)育調(diào)控機理的研究。
2.人參皂甙對小鼠A型精原細胞增殖的影響
利用精原細胞-體細胞共培養(yǎng)體系來評價GSX寸小鼠A型精原細胞增殖的調(diào)控作用。精原細胞培養(yǎng)72 h后,GS(1.O~10μg/ml)能夠顯著刺激A型精原細胞的增殖,精原細胞集落的數(shù)目和面積均顯著高于對照組。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的
7、激活劑佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA,10-8~10-7 mol/L)顯著促進精原細胞的增殖,這一作用可被PKC的抑制劑H7所抑制。此外,腺苷酸環(huán)化酶激活劑福司克林(forskolin,FSK,10-6~10-5 mol/L)也可刺激小鼠A型精原細胞的增殖,這一作用可被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制劑H89所抑制。這些結(jié)果表明PKA和PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活均能促進
8、A型精原細胞的增殖。此外,GS和PMA具有協(xié)同作用。H7可顯著抑制GS誘導(dǎo)的A型精原細胞的增殖。然而,H89對GS誘導(dǎo)的A型精原細胞增殖無顯著影響,說明GS的作用并不是通過PKA信號途徑介導(dǎo)的。以上的結(jié)果表明PKA和PKC信號通路在小鼠A型精原細胞的增殖過程中起著重要的調(diào)控作用,GS可能通過PKC介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進小鼠A型精原細胞的增殖。
3.大豆黃酮對多氯聯(lián)苯引起的小鼠睪丸生殖細胞損傷的緩解作用
A型精
9、原細胞在體外培養(yǎng)時呈集落生長,而3周齡小鼠的生殖細胞呈單個生長,更利于散在細胞形態(tài)變化的觀察,因此,本實驗利用體外培養(yǎng)的小鼠睪丸生殖細胞研究了典型內(nèi)分泌干擾物多氯聯(lián)苯Aroclor1254(A1254)對生殖細胞損傷的機理,并探討了DAI對A1254引起的睪丸生殖細胞氧化損傷的緩解作用及其作用機制。DAI是一類廣泛分布在豆類植物中的多酚類化合物,具有抗氧化作用。多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是一
10、類難分解的氯代芳烴族環(huán)境污染物,對人和動物的各種組織都有很強的毒性作用,特別易誘發(fā)發(fā)育異常和生殖系統(tǒng)的損傷。本實驗用活性氧自由基產(chǎn)生系統(tǒng)次黃嘌呤(hypoxanthine,HX)/黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)系統(tǒng)來評價DAI的抗氧化作用。結(jié)果表明,A1254(20~30μg/ml)以及HX/XO系統(tǒng)(10-5~mol/L;2.5×10-3 IU/ml)產(chǎn)生的活性氧對睪丸生殖細胞具有嚴(yán)重的損傷作用,導(dǎo)致細胞破裂,
11、存活的細胞數(shù)目明顯減少。DAI(10μg/ml)可明顯緩解A1254或HX/XO系統(tǒng)引起的生殖細胞的氧化損傷,使存活的細胞數(shù)目顯著增加,并恢復(fù)A1254引起的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平的下降以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成的增加。結(jié)果說明DAI具有抗氧化活性,能夠緩解A1254引起的生殖系統(tǒng)氧化損傷,因此DAI對于A125
12、4引起的生殖毒性具有重要的緩解作用。
4.人參皂甙對小鼠卵母細胞成熟的影響
本實驗利用小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)模型研究GS對卵母細胞減數(shù)分裂成熟的影響,從而進一步評價GS對生殖健康的作用。處于生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期的卵丘卵母細胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes,COC)和去卵丘的卵母細胞(denuded oocytes,DO)取自于性未成熟的ICR小鼠。生發(fā)泡破
13、裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第—極體(firstpolar body,PB1)排出的情況作為判斷卵母細胞減數(shù)分裂成熟的指標(biāo)。HX(4 mmol/L)可抑制卵母細胞的自發(fā)成熟。FSH能克服HX的抑制,顯著誘導(dǎo)COC恢復(fù)減數(shù)分裂成熟。以上的結(jié)果說明HX維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯的體外培養(yǎng)系統(tǒng)是能夠模擬體內(nèi)環(huán)境研究外源因素對卵母細胞發(fā)育成熟影響的合適模型。本實驗利用該培養(yǎng)模型研究了GS對卵母細胞成熟的影
14、響,結(jié)果表明1.0~10μg/ml的GS可克服HX維持的減數(shù)分裂阻滯,促進COC恢復(fù)減數(shù)分裂成熟,GVBD發(fā)生率和PB1排出率顯著提高,而GS對DO沒有作用。此外,GS(1.0μg/ml)和FSH(0.1 IU/ml)具有協(xié)同作用。TMX和Nω硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethyl ester,L-NAME,一種NO合酶抑制劑)被用來研究GS誘導(dǎo)卵母細胞減數(shù)分裂成熟的機制。TMX對GS誘導(dǎo)的卵母細胞減數(shù)
15、分裂無顯著影響,說明GS并不是通過雌激素樣作用介導(dǎo)的。L-NAME(1 mmol/L)可顯著抑制GS誘導(dǎo)的減數(shù)分裂成熟,GVBD發(fā)生率和PB1排出率顯著低于GS處理組。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果也表明GS能增加卵丘細胞上誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達,L-NAME則可抑制GS引起的iNOS表達的增加。結(jié)果表明GS可能通過NO/iNOS體系以旁分泌的方式促進小鼠卵母細胞的
16、成熟。結(jié)論:
本實驗建立了小鼠雄性的A型精原細胞和雌性的卵母細胞體外培養(yǎng)模型,發(fā)現(xiàn)添加胰島素、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白的ITS培養(yǎng)體系能夠很好地維持精原細胞的存活。多種生殖激素(FSH、T和E2)和生長因子EGF均能夠促進A型精原細胞的增殖。此外,PKA和PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活也可促進精原細胞的增殖。GS通過PKC信號途徑促進A型精原細胞的增殖。此外,植物性抗氧化劑DAI可以通過抗氧化活性緩解A1254引起的生殖細胞的氧化損傷
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