生殖細(xì)胞體外分化過程中LncRNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、目的:
　　1.建立體外誘導(dǎo)小鼠原始生殖樣細(xì)胞(primordial germ cell-like cells，PGCLCs)分化體系。
　　2.鑒定體外誘導(dǎo)小鼠原始生殖細(xì)胞分化過程中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)表達(dá)量的變化。
　　3.對(duì)小鼠原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。
　　4.獲取小鼠體內(nèi)原始生殖細(xì)胞分化過程E5.5天外胚層細(xì)胞和E12.5天

2、原始生殖細(xì)胞。
　　方法:
　　首先，模擬小鼠原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)體內(nèi)分化生成過程，在體外經(jīng)過兩步誘導(dǎo)方法建立PGCLCs誘導(dǎo)體系。起始細(xì)胞使用小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)，先經(jīng)過兩天貼壁培養(yǎng)誘導(dǎo)成為扁平狀的外胚層樣細(xì)胞(Epiblast-like cells，EpiLCs)，然后取合適的細(xì)胞數(shù)量采用懸滴培養(yǎng)的方式繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5天獲得原始生殖樣細(xì)胞(Primordial ger

3、m cell-like cells，PGCLCs)。使用PGCs分化特異性的標(biāo)記基因Blimp1-GFP指示體外誘導(dǎo)前期階段的成功，然后在需要收取分化樣品的第4天用CD61和SSEA1來進(jìn)行流式分選獲取完整的PGCLCs群體。對(duì)各階段獲取的細(xì)胞樣品，提取RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，用QPCR檢測(cè)其各階段標(biāo)志性的基因，以證明體外原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)成功。
　　總RNA中含有80％以上的rRNA，所以普通的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中含有大量的rRNA的數(shù)

4、據(jù)，這就在很大程度上影響測(cè)序數(shù)據(jù)中的lncRNA的數(shù)據(jù)含量，所以采用illumina公司的rRNA Removal kit，利用具有rRNA反向序列互補(bǔ)的DNA探針與rRNA進(jìn)行雜交去除掉樣品中的rRNA并且富集樣品的時(shí)候并沒有使用具有Oligo(dT)的磁珠，這樣，不帶有Poly A尾的RNA也可以被獲取，因此相比于普通的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，可以獲得更多的數(shù)量和種類的lncRNA數(shù)據(jù)。
　　對(duì)樣品全基因轉(zhuǎn)錄組水平的測(cè)序，使用illumi

5、na平臺(tái)的PE150雙端測(cè)序，每個(gè)樣品平均獲得30M的數(shù)據(jù)量。使用Gencode對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)、分類。以FPKM的值指征其表達(dá)量，接著分析了誘導(dǎo)的兩個(gè)階段標(biāo)志性基因的轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)量，一方面驗(yàn)證數(shù)據(jù)的真實(shí)性，另外也可從側(cè)面再次驗(yàn)證體外誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞是否成功。在判斷基因在不同樣品之間表達(dá)量的差別時(shí)，定義不同樣品之間FC(fold change)≥2為差異顯著。通過不同組別樣品之間的比較，最終確定了在PGCLC中高表達(dá)，ESC中低表

6、達(dá)的38種lncRNA，對(duì)其中差異最大的前十種lncRNA進(jìn)行了QPCR的驗(yàn)證，最終驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了其中八種lncRNA在PGCLC中的表達(dá)量確實(shí)高于其在ESC中的表達(dá)量，并且以lncRNA-GM29156、GM-39397和GM-20005的表達(dá)差異最為顯著。接著，用catRAPID預(yù)測(cè)和這三種lncRNA相互作用的蛋白，看到其相互作用蛋白都與配子發(fā)生相關(guān)，另外其參與了G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路以及細(xì)胞表面受體信號(hào)通路。
　　結(jié)果:

7、>　　針對(duì)體外誘導(dǎo)體系不同的時(shí)間點(diǎn)，同樣獲取了小鼠體內(nèi)胚胎發(fā)育第5.5天(E5.5)外胚層細(xì)胞和第12.5天(E2.5)原始生殖細(xì)胞。為了操作簡(jiǎn)便和獲取更加純凈的細(xì)胞群體，使用了Oct4-GFP的轉(zhuǎn)基因C57小鼠。在E5.5天的外胚層細(xì)胞中會(huì)特異性的表達(dá)Oct4，因此在熒光顯微鏡下會(huì)看到明顯的GFP熒光，使用粗細(xì)合適的玻璃針沿著GFP的邊緣切取所需的外胚層細(xì)胞;在E12.5天的胚胎中，原始生殖細(xì)胞同樣特異性表達(dá)Oct4，因此在體視顯微鏡

8、下剝離中腎和生殖脊，然后進(jìn)行流式分選GFP陽性的細(xì)胞群體，即需要的原始生殖細(xì)胞，之后用同樣的方法對(duì)小鼠體內(nèi)樣品進(jìn)行建庫擴(kuò)增。
　　結(jié)論:
　　1.建立了體外原始生殖樣細(xì)胞的誘導(dǎo)體系。
　　2.成功獲取體外誘導(dǎo)原始生殖樣細(xì)胞過程完整的lncRNA的表達(dá)特點(diǎn)。
　　3.驗(yàn)證了ESC和PGCLC表達(dá)量差異最為顯著的十種lncRNA，并預(yù)測(cè)了與其中前三種lncRNA相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)其這些lncRNA相互作用蛋白主要與