人類多潛能干細胞體外分化紅細胞發(fā)育過程中表型分子的研究.pdf

1、目的:人類多潛能干細胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）主要包括人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人誘導性多潛能干細胞(humaninduced pluripotent stem cells，hiPSCs)，二者兼具體外自我更新、無限增殖及多分化潛能的特性。它們的成功建株，極大地推動了干細胞基礎研究和臨床應用研究。研究的一個重要方向是將hPSCs向特定

2、譜系的成熟血液細胞定向誘導分化。
　　因為一直沒有合適的研究人類早期造血發(fā)生的模型，以往的研究主要都是基于小鼠等動物模型。hESCs體外誘導分化紅細胞的過程，模擬了人類胚胎期體內紅系發(fā)生發(fā)育過程，為研究紅細胞正常發(fā)育的調控機理奠定了實驗基礎。另一方面，利用患者hiPSCs體系建立體外誘導分化紅細胞的方法，將為研究紅細胞早期發(fā)育異常相關疾病的致病機理和開發(fā)個體化治療手段提供理想的平臺。
　　在所有血細胞中，成熟紅細胞因為不含細

3、胞核，并攜帶著最小量的遺傳物質，壽命較長等特點，有望作為最早的干細胞來源的細胞治療產品而應用于臨床。但在成功實現hPSC來源的紅細胞臨床應用前，還存在諸多問題需解決，例如:培養(yǎng)體系的不健全導致的體外擴增效率低、成熟程度低;脫核調控機制不明;沒有合適的活體移植模型等。這些困難需要通過對hPSC來源紅細胞的發(fā)生和成熟過程中的關鍵調控機理的理解來攻克。
　　為了精密地研究hPSCs體外誘導分化紅細胞的發(fā)育過程，在方法學上有兩個亟待解決的

4、問題。(1)現有實驗數據已顯示不同誘導體系產生的紅細胞成熟程度有差異。這種差異指向一個事實，即成體造血微環(huán)境來源的基質細胞的誘導對hPSCs產生成熟紅細胞是必需的。所以需要建立一套高效并趨于自然的共培養(yǎng)方法，以得到類似于自然發(fā)育過程產生的成熟紅細胞。(2) hPSC來源的紅細胞分化培養(yǎng)體系中，同時存在原始造血及成體造血過程，并且紅細胞在早期發(fā)育存在不同的發(fā)育階段。為了辨別不同的細胞，需要建立一種快捷、方便且準確的標識方法。在成體干細胞向

5、紅細胞分化發(fā)育過程的研究領域，已成功利用表型分子來區(qū)分紅細胞的不同發(fā)育階段，啟示我們也可能利用表型分子來區(qū)分hPSC來源紅細胞的早期不同發(fā)育階段。
　　方法:我們比較了不同的成體造血微環(huán)境來源的基質細胞，選擇了小鼠主動脈-性腺-中腎（Aorta-Gonad-Mesonephros，AGM）細胞作為共培養(yǎng)體系的基質細胞。AGM區(qū)域是最早的支持成體造血的位點。我們建立了將hPSCs與AGM來源的細胞系AGM-S3體外向紅細胞分化的培養(yǎng)

6、方法。首先將hPSCs細胞與AGM-S3細胞系先共培養(yǎng)誘導造血分化的發(fā)生，再經懸浮培養(yǎng)向紅細胞定向分化并擴增。以成體干細胞hCB-CD34+來源的紅細胞為對照，用先進的多色流式分析技術，探索hPSCs與AGM-S3共培養(yǎng)來源紅細胞特異的表型分子表達譜系。隨后以分別表達特異表型分子的紅細胞亞群GPA+CD36-和GPA+CD34+為切入點，利用熒光激活細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting，FAC

7、S)技術，精確地將各目標細胞亞群分選出。然后利用瑞姬氏(May-Grunwald-Giemsa，MGG)染色方法觀察細胞形態(tài)，通過免疫熒光染色方法考察血紅蛋白組分來評價紅細胞的成熟程度，并采用qRT-PCR技術檢測造血及紅細胞發(fā)育相關的重要基因的轉錄水平。
　　結果與結論:我們建立了高效的hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)造血誘導分化體系，可以產生大量的高純度和高成熟度紅細胞，共培養(yǎng)12天再懸浮培養(yǎng)24天時，紅細胞數量約為起始未分化H1

8、細胞數量的300倍，其中85％以上表達成體型血紅蛋白β。hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)體系來源的紅細胞β血紅蛋白的表達率遠遠高于其他實驗室報道的數據。
　　我們在這個高效體系上進一步研究了hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)體系來源紅細胞發(fā)育過程的表型分子表達譜系，發(fā)現共培養(yǎng)階段紅系特有的表型分子GPA陽性(GPA+)細胞上的其他共表達表型分子模式與已知的成體型紅細胞的發(fā)育模式不同。其中GPA和成熟紅細胞的特定分子CD36和造血干細胞的特有

9、分子CD34的共表達均存在hPSCs分化發(fā)育的特有模式。我們根據這兩條線索，進行了進一步細致地研究工作。
　　本工作通過精密細致地研究，首次發(fā)現并論證了hPSC來源的早期紅細胞可根據GPA和CD36抗原的共表達的表達變化指示不同的發(fā)育階段。在共培養(yǎng)階段相當長一段時間（6-18天）紅細胞表型為GPA+CD36-，懸浮培養(yǎng)后逐漸變?yōu)镚PA+CD36low/+，10+5天時達到一半左右，然后又再逐漸變?yōu)镚PA+CD36-。我們在不同時間

10、點將CD36表達不同的紅細胞亞群利用流式分選技術分離出來，通過對特定紅細胞亞群Hb組分、表型分子及基因轉錄相對水平的比較，進一步揭示了這一系列的表型變化過程同時伴隨著中胚層及內皮細胞特性的丟失，原始造血向成體造血特性的轉變以及紅細胞成熟度逐漸升高等變化過程。綜合我們的實驗數據，提示紅細胞的初期發(fā)育是源于中胚層向內皮造血的途徑，遠在成體造血干/祖細胞被確定誕生之前。
　　進一步的研究還發(fā)現hPSC/AGM-S3共培養(yǎng)階段紅細胞最初存