Gdf6和Egr2在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分:
　　肥胖是指人體脂肪的過量儲存，其產(chǎn)生是由于脂肪細胞體積增大和數(shù)目增多。其中，脂肪細胞數(shù)目增多是由于脂肪組織中多潛能干細胞向前脂肪細胞定向的增多，后者在一定環(huán)境因素的作用下分化為成熟的脂肪細胞。從多潛能干細胞發(fā)育成為脂肪細胞是一個多步驟的過程，包括多潛能干細胞向前脂肪細胞定向、前脂肪細胞增殖、生長抑制及前脂肪細胞的終末分化。目前的研究主要集中于從前脂肪細胞到成熟脂肪細胞的終末分化過程，對于如何從多潛能干細胞向前脂肪細胞

2、定向研究甚少。
　　我們實驗室以前的研究表明BMP4能促使C3H10T1/2多潛能干細胞定向為前脂肪細胞，Huang等發(fā)現(xiàn)BMP4是通過Smad及p38 MAPK兩條信號通路發(fā)揮作用，那么BMP家族的其他成員在C3H10T1/2向脂肪細胞系定向過程中發(fā)揮著怎樣的作用呢？生長分化因子6(Gdf6，又稱BMP13)是BMP家族的一員。已有研究發(fā)現(xiàn)Gdf6在中胚層來源的細胞的發(fā)育分化中發(fā)揮作用，如骨細胞和軟骨細胞。在本課題中，我們主要研

3、究了Gdf6對C3H10T1/2多潛能干細胞向脂肪細胞系的定向中的作用及機制。我們首先利用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)將Gdf6基因?qū)隒3H10T1/2多潛能干細胞，發(fā)現(xiàn)Gdf6能夠促使C3H10T1/2多潛能干細胞向前脂肪細胞定向，并在標準脂肪細胞分化方案誘導(dǎo)下分化為成熟的脂肪細胞。細胞由成纖維形態(tài)變?yōu)閳A形，胞漿內(nèi)聚集甘油三酯，脂肪細胞特異性蛋白PPARγ和422/aP2表達。Gdf6因此成為除BMP4以外能夠促進多潛能干細胞向前脂肪細胞定向

4、的又一重要細胞因子。
　　BMP受體主要可激活兩條重要的信號通路，即Smad和p38 MAPK信號通路。我們檢測了表達Gdf6的C3H10T1/2多潛能干細胞其下游信號通路激活情況。Smad和p38 MAPK信號通路均可被Gdf6激活。我們應(yīng)用RNA干擾手段下調(diào)了表達Gdf6的C3H10T1/2細胞內(nèi)共介導(dǎo)Smad即Smad4以及p38 MAPK的蛋白水平，以阻斷這兩條信號通路。結(jié)果顯示下調(diào)Smad4蛋白水平能明顯抑制Gdf6引起

5、的多潛能干細胞向前脂肪細胞定向，p38 MAPK下調(diào)以后Gdf6引起的多潛能干細胞向前脂肪細胞定向被部分抑制，當(dāng)共同轉(zhuǎn)染了Smad4和p38 RNAi時，Gdf6引起的定向幾乎被完全抑制。以上結(jié)果表明Gdf6促進C3H10T1/2多潛能干細胞向前脂肪細胞定向依賴Smad和p38 MAPK兩條信號通路。
　　為了進一步研究Gdf6在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中作用機制，我們觀察了不同類型受體在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向中的作

6、用。首先，我們檢測了C3H10T1/2多潛能干細胞內(nèi)各種類型BMP受體mRNA表達水平。結(jié)果表明C3H10T1/2細胞表達Bmpr1a，Bmpr2和Acvr2a，其中Bmpr2的表達水平顯著高于Acvr2a，而Bmpr1b和Acvr2b則不表達。接下來，我們利用RNA干擾手段敲低Bmpr1a，Bmpr2和Acvr2a的表達。結(jié)果顯示Bmpr1a下調(diào)完全抑制了Gdf6促進多潛能干細胞向前脂肪細胞定向，而Bmpr2和Acvr2a的下調(diào)能部分

7、阻礙Gdf6引起的定向，其中Bmpr2下調(diào)后對定向的抑制更顯著。當(dāng)共同轉(zhuǎn)染Bmpr2和Acvr2a的RNAi時，Gdf6引起的多潛能干細胞向前脂肪細胞定向被完全抑制。這一系列結(jié)果證實了Gdf6促進多潛能干細胞向前脂肪細胞定向是通過Bmpr1a，Bmpr2和Acvr2a共同實現(xiàn)的。
　　Runx1t1，又被稱為ETO或MTG8，全稱白血病異位基因8，最早被發(fā)現(xiàn)參與t(8;21)急性髓系自血病的發(fā)病。在多種人體組織，如腦、心臟、骨骼肌

8、和脂肪組織均能檢測到Runx1t1的表達。此前的研究發(fā)現(xiàn)Runx1t1能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞的終末分化。然而在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中是否發(fā)揮作用尚不清楚。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在BMP4和Gdf6誘導(dǎo)的多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中，Runx1t1的表達均顯著下調(diào)。為進一步明確Runx1t1在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中的作用，我們構(gòu)建了Runx1t1的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體感染C3H10T1/2細胞，從而達到過表

9、達Runx1t1的目的。結(jié)果顯示，Runx1t1過表達顯著地抑制Gdf6或BMP4引起的多潛能干細胞向前脂肪細胞定向。這些結(jié)果說明Runx1t1在前脂肪細胞定向過程中發(fā)揮著負向調(diào)控作用。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，Gdf6通過BMPⅠ型受體Bmpr1a以及BMPⅡ型受體Bmpr2和Acvr2a激活Smad和p38 MAPK信號通路，從而促進C3H10T1/2多潛能干細胞向前脂肪細胞定向。Runx1t1的下調(diào)對于Gdf6或BMP

10、4引起C3H10T1/2多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程是必需的。至于Runx1t1抑制定向的具體作用機制有待后續(xù)試驗的進一步研究。
　　第二部分:
　　肥胖是指人體脂肪的過量儲存，表現(xiàn)為脂肪細胞體積增大和數(shù)目增多。其中，脂肪細胞數(shù)目增多是由于脂肪組織中多潛能干細胞向前脂肪細胞定向的增多，后者在一定環(huán)境因素的作用下分化為成熟的脂肪細胞。多潛能干細胞具有多向分化潛能，在合適的誘導(dǎo)條件下能夠分化成為脂肪細胞，肌肉細胞，骨細胞和軟

11、骨細胞。其中，從多潛能干細胞發(fā)育為成熟脂肪細胞需要經(jīng)歷一系列精確調(diào)控的級聯(lián)過程，主要可以被劃分為兩個階段:多潛能干細胞定向為前脂肪細胞;前脂肪細胞終末分化為成熟的脂肪細胞。本實驗室以前的研究表明BMP4能促使C3H10T1/2多潛能干細胞定向為前脂肪細胞，這為我們研究多潛能干細胞向前脂肪細胞的定向過程提供了良好的細胞模型。Tgfβ1，轉(zhuǎn)化生長因子β1，Tgfβ超家族的另一成員，能夠促進多種前體細胞，如C3H10T1/2多潛能干細胞，神經(jīng)

12、嵴Monc-1細胞（多潛能神經(jīng)嵴干細胞），以及已分化細胞，如巨噬細胞，分化或轉(zhuǎn)分化為平滑肌樣細胞，表達平滑肌細胞特異性基因。由于間充質(zhì)干細胞的命運決定往往是相互平衡和制約的，誘導(dǎo)細胞向某一方向的定向分化常常抑制其向另一方向的發(fā)育分化。而對于多潛能干細胞命運決定的分子機制，有待進一步的研究加以闡明。
　　Egr2，全稱早期生長反應(yīng)基因2，是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。Egr2擁有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠與靶基因富含GC序列的啟動

13、子結(jié)合，調(diào)控其下游基因的表達。Egr2能夠被多種細胞外信號誘導(dǎo)表達，如生長因子，細胞因子，低氧及細胞應(yīng)激等等。Egr2在各類細胞的增殖，分化和凋亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，Egr2對于后腦的發(fā)育和外周神經(jīng)的髓鞘化是必需的，并且Egr2能夠通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原的產(chǎn)生參與腱的分化。另外Egr2是Tgfβ1引起的纖維化反應(yīng)的下游基因，能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用促進膠原基因的表達。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，Egr2在3T3-L1前脂肪細胞終末分化的過程中通

14、過C/EBPβ依賴和非依賴的機制發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。然而，在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向的過程中，Egr2發(fā)揮了什么作用目前尚無報道。
　　我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過BMP4誘導(dǎo)的C3H10T1/2多潛能干細胞定向為前脂肪細胞，Egr2的表達水平明顯下降。C3H10T1/2多潛能干細胞定向過程中，BMP主要激活兩條重要的信號通路，Smad和p38 MAPK信號通路。我們利用RNA干擾手段下調(diào)了Smad4或p38 MAPK的蛋白水平，從而

15、達到阻斷BMP信號通路的目的。結(jié)果顯示阻斷Smad4或p38 MAPK信號通路能明顯恢復(fù)BMP4抑制的Egr2表達。
　　為進一步研究Egr2在這一過程中的作用機制，我們構(gòu)建了Egr2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體，并感染C3H10T1/2細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Egr2過表達顯著地抑制多潛能干細胞向前脂肪細胞定向。檢測平滑肌細胞分化的特異性基因發(fā)現(xiàn)，過表達Egr2的C3H10T1/2細胞，其平滑肌細胞特異性基因，如α-SMA，Cnn1，Sm22α，

16、Sm22β，Srf和Myocd，mRNA表達水平明顯上調(diào)，Western blotting和免疫熒光結(jié)果顯示，過表達Egr2的細胞α-SMA和Cnn1蛋白水平明顯高于對照組，細胞形態(tài)呈長梭形。這些結(jié)果表明，Egr2抑制C3H10T1/2細胞向脂肪細胞系的定向，促進其向發(fā)育分化為平滑肌樣細胞。
　　Tgfβ1是平滑肌細胞分化重要誘導(dǎo)因子。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Egr2能夠促進Tgfβ1基因的表達，進而激活Tgfβ1/Smad3信號通

17、路。應(yīng)用Tgfβ1的中和抗體以拮抗細胞分泌的Tgfβ1，以阻斷Tgfβ1信號通路。結(jié)果顯示，Egr2引起的Smad3磷酸化被明顯抑制，然而平滑肌細胞特異性基因，如α-SMA，Cnn1，Sm22α，Sm22β，Srf和Myocd，mRNA表達水平以及α-SMA和Cnn1蛋白水平，在加入中和抗體組和對照組并無明顯差異。以上結(jié)果證明，Egr2促進C3H10T1/2細胞向平滑肌樣細胞的分化是不依賴于Tgfβ1信號通路的。Egr2作為轉(zhuǎn)錄因子，能

18、夠直接結(jié)合目的基因的啟動子并激活其轉(zhuǎn)錄水平。我們應(yīng)用熒光報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，Egr2對Cnn1和Sm22α的啟動子有顯著的激活作用，染色質(zhì)免疫共沉淀的結(jié)果也顯示，Egr2能夠富集到Cnn1和Sm22α基因的啟動子區(qū)域。以上結(jié)果證實，Egr2發(fā)揮其促進C3H10T1/2細胞向平滑肌樣細胞的發(fā)育分化是通過對平滑肌細胞特異性基因Cnn1和Sm22α的轉(zhuǎn)錄激活實現(xiàn)的。
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)了Egr2在多潛能C3H10T1/2細胞的命